11．大肠杆菌菌群数量是衡量食品安全的一项重要指标．下面是检测食品中大肠菌群的常用方法：稀释培养测数法（MPN）．
（一）实验原理
（1）大肠杆菌菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气的无芽孢杆菌．
（2）乳糖胆盐发酵管中溴甲酚紫的作用：用溴甲酚紫作指示剂，该指示剂中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色．胆盐的作用：胆盐对很多杂菌有抑制作用，但是对大肠杆菌不造成影响．
（3）伊红美蓝能使大肠杆菌菌落呈深紫色．
（二）实验试剂及器材（略）
（三）实验过程
（1）检样稀释
①将检样25mL放于有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液．
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液．按上述操作依次做10倍梯度稀释液，每稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管．
（2）乳糖发酵试验
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管乳糖胆盐发酵管．置于36℃温箱内，培养24h，若①，则可报告为大肠菌群阴性；若②，则可报告为大肠菌群阳性．
（3）分离培养
将大肠菌群阳性的发酵管分别转种在③琼脂平板上，置36℃温箱内，培养24h，然后取出，观察④．
（4）报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值．
请回答下列问题：
①请把上述空缺步骤补充完整：
①所有发酵管中溶液呈蓝紫色（或都不产气）②所有发酵管中溶液呈黄色（或有产气者）③伊红美蓝④菌落颜色
②培养基中必须含有的基本成分是水、无机盐、碳源、氮源．
③在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养24h，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格．
④若步骤三采用平板划线法分离培养大肠杆菌，操作时，接种环应通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线．这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落．
10．柴油是重要的燃料油之一，也因泄露与不当排放等造成了严重的环境污染．科研人员从遭受柴油污染的土壤样品中取土样5g，加入含100mL培养基M的锥形瓶中，在30℃条件下震荡培养5天，取出5mL培养液接种到相同的新鲜培养基，按此步骤连续培养5次，分离获得醋酸钙不动杆菌DB（一种柴油降解菌）．利用该菌，科研人员进一步探索其降解柴油的最佳条件，获得实验结果如图．请回答下列问题：

（1）为获得醋酸钙不动杆菌DB，培养基M应以柴油为唯一碳源，还要考虑无机盐的种类和比例．
（2）在实验过程中，科研人员“30℃条件下震荡培养5天，取出5mL培养液接种到相同的新鲜培养基，按此步骤，连续培养5次”的主要目的是使醋酸钙不动杆菌DB的数量增加．
（3）在分裂醋酸钙不动杆菌DB操作时，在严格无菌条件下，采用平板划线法（填接种方法）在制备好的牛肉膏蛋白胨培养基上进行接种，接种完，对接种环进行灼烧灭菌处理．培养一段时间后，观察、挑取平板上形态、颜色、大小和隆起度等一致的菌落进行重复培养，直到分离出单一菌株．
（4）据图分析，若某地区土壤发生柴油重度污染时，则可以将对被柴油重度污染的土壤进行稀释，使柴油浓度降低至4000mg．kg-1左右，并添加浓度为6mg．g-1的表面活性剂，以有利于提高对柴油的降解效果．
9．人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值．
为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究．请回答下列问题：
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是③ （填序号）．
①酒精灯  ②培养皿  ③显微镜  ④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果．
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是避免培养基污染棉塞．
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应．研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见图1）． 图中降解圈大小与纤维素酶的量与活性 有关． 图中降解纤维素能力最强的菌株是①（填图中序号）．

（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见图2，推测菌株J4 更适合用于人工瘤胃发酵，理由是发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高．
8．生物技术与社会现象、生产实际联系密切，请回答下列关于生物技术实践的问题．
（1）在果酒果醋的自然发酵过程中，酵母菌的来源是附着在果皮上的野生型酵母菌，发酵装置内加入果汁后要留出约$\frac{1}{3}$的空间，目的是有利于酵母菌有氧呼吸并进行快速繁殖；防止发酵过程中产生二氧化碳造成发酵液溢出．酒精发酵后转入醋酸发酵前，除改变温度外，还需调整的发酵条件是通入无菌空气．
（2）普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种：

图一中的②、③过程需重复几次，目的是进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌．某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图二所示，推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀．
（3）制备固定化酵母细胞时要将干酵母活化，并将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中，以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的氯化钙溶液中，观察凝胶珠的形成．
（4）DNA粗提取与鉴定实验中，对最后得到絮状物进行鉴定时，先取两支试管，分别加入等量的2mol/L的NaCl溶液，其中向一支试管加入絮状物，再向两试管中各加入4mL二苯胺试剂，混合均匀，后续进一步的操作是将试管置于沸水中加入5分钟（等冷却后），比较两支试管中溶液的颜色．
7．荷斯坦牛以产奶量高而闻名于世，如果利用生物工程技术培育优良荷斯坦牛．请回答：
（1）利用促性腺激素处理适龄奶牛，使其超数排卵，采集的卵母细胞培育到减数第二次分裂中期，在显微镜下可以观察到次级卵母细胞和第一极体．
（2）在体外受精前一般要对精子进行处理，目的是使其获能．
（3）为了得到同卵多胎，在胚胎发育到桑椹胚或囊胚时，进行胚胎分割，在这个过程中，要将内细胞团   均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和发育．
（4）在奶牛出生前要确定荷斯坦牛的性别，可以利用少量胚胎细胞进行性别鉴定，该技术采用的方法是用基因探针进行DNA杂交．
（5）荷斯坦牛的胚胎干细胞可从早期胚胎或原始性腺中分离获取．
6．如图表示用于预防和治疗禽流感的单克隆抗体生产过程，请回答下列问题：

（1）若A细胞是小鼠的骨髓瘤细胞，则B细胞取自感染禽流感病毒的动物或人　体内的B淋巴细胞，促进d过程的诱导剂是聚乙二醇或灭活的病毒．
（2）假设仅考虑两个细胞的融合，则可形成3种类型的C细胞，因此需用选择性培养基筛选出具有既能无限增殖又能产生特异性抗体特点的D细胞用于培养．D细胞的名称是杂交瘤细胞．
（3）在细胞培养所用的培养基中除需要加入糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量元素外，通常还需加入血清、血浆等一些天然成分．
（4）目前注射禽流感疫苗是预防禽流感的一种措施．决定禽流感病毒在人体细胞中增殖变化的物质是禽流感病毒的RNA．
5．下列有关生物技术实践的叙述，正确的是（　　）
A．在制备果酒、果醋和腐乳的过程中都要持续通入氧气
B．用二苯胺试剂鉴定DNA时需设置对照实验
C．加酶洗衣粉中的酶制剂都能直接去除衣物上的污垢
D．固定化细胞和固定化酶都需要一定的营养条件
4．生态农业不仅指对于农作物中所含物质、能量的充分利用，还包括很多的内涵．人们越来越认识到根据不同地区的土地、光、水等各种自然资源，设计出适合本地的生态农业结构的重要意义．下列措施中不符合生态学原理的是（　　）
A．作物“轮种”不仅合理地利用各种矿质营养，还可避免某些虫害的大发生
B．以作物秸秆为燃料发电，可以做到对农作物中物质和能量的多级利用
C．充分利用各种生物固氮措施，尽量施用农家肥，减少化肥的施用
D．应用以虫治虫、以菌治虫
3．下列有关哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，不正确的是（　　）
A．移植用的胚胎一般取桑椹胚或囊胚
B．滋养层细胞发育成胎膜和胎盘
C．分割囊胚阶段的内细胞团要求均等
D．卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加
2．根据所学生物学知识回答下列问题：
（1）蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质．
（2）扩增目的基因的过程可以在PCR仪中自动完成，目前治疗遗传病最有效的手段是基因治疗．
（3）运用基因工程技术已经创造出了“蜘蛛羊”，该羊的乳汁中含有蛛丝蛋白．为保证实验成功，产生蛛丝蛋白的基因需从部分基因文库（保存着大量反转录产生的DNA片段）中获取，并与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，然后与载体结合构成基因表达载体．
（4）哺乳动物卵子的形成和在卵巢内的储备，是在出生前完成的，这是精子和卵子在发生上的重要区别．
（5）生态系统内即使某个物种由于某种原因而死亡，也会很快有其他物种占据它原来的生态位置，从而避免系统结构或功能失衡．这主要体现了生态工程的什么原理B
A．协调与平衡原理    B．物种多样性原理
C．物质循环再生原理   D．整体性原理．
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