题目内容
15．草甘膦是一种非选择性、无残留灭生性除草剂．科学家从土壤农杆菌变种CP4中分离到抗草甘膦酶的基因，并转移到无抗草甘膦的大豆中，从而得到新的大豆品种．请回答：（1）在构建目的基因表达载体时，需用同种限制性核酸内切酶对含编码抗草甘膦酶基因的DNA和运载体进行酶切．
（2）基因表达载体除了带有抗草甘膦酶的基因以外，还必须含有启动子、终止子和标记基因等．
（3）请写出两种检测目的基因是否表达的方法：抗原-抗体杂交法和喷施草甘膦溶液．
（4）在检测进口大豆是否为转基因产品时，可用核酸探针进行检测．核酸探针可以用PCR技术进行基因克隆，此克隆过程是利用DNA复制的原理，利用该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，需加入的酶是耐高温的DNA聚合（Taq）酶．
分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．
解答 解：（1）构建基因表达载体时，需用同种限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA．
（2）基因表达载体的组成包括目的基因（抗草甘膦酶的基因）、启动子、终止子和标记基因等．
（3）检测目的基因是否表达的方法：从分子水平上检测，可采用抗原-抗体杂交法；从个体水平上鉴定，可喷施草甘膦溶液，观察大豆的生存情况．
（4）基因克隆属于分子水平的克隆，可采用PCR技术，其原理是DNA复制；采用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列；PCR技术中有高温变性过程，因此需加入的酶是耐高温的DNA聚合（Taq）酶．
故答案为：
（1）限制性核酸内切
（2）标记基因
（3）抗原-抗体杂交法 喷施草甘膦溶液
（4）PCR DNA复制 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 耐高温的DNA聚合（Taq）酶
点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节；识记PCR技术的概念、原理、条件及过程，能结合所学的知识准确答题．
（1）Cas9系统最早在细菌体内发现，是细菌用来抵御噬菌体DNA等外源DNA片段入侵而建立的机制，相当于人类的免疫系统．
（2）为敲除Vash2基因，需要设计sgRNA（单链向导RNA），由图可知，sgRNA的一段序列能与Vash2基因进行碱基互补配对．研究者通过显微注射技术将sgRNA和Cas9mRNA导入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引导由Cas9mRNA通过翻译过程产生的Cas9酶在配对区域定点剪切，使Vash2基因片段Ⅱ（填图中罗马数字）发生缺失从而导致基因突变．
（3）被敲除基因的鼠经胚胎移植，最后获得44只F0代小鼠，经PCR检测和基因测序，从中选出1号、3号、5号、39号为阳性高效敲除小鼠．由于是随机敲除，导致不同个体丢失的基因片段大小不同，具体情况见表
| 编号 | 敲除的总片段长度（bp） | 敲除的有效片段长度（bp） |
| 1（♂） | 169 | 169 |
| 3（♂） | 196 | 196 |
| 5（♀） | 429 | 268 |
| 39（♀） | 483 | 200 |
（4）F1代小鼠相互交配得到F2代，将F2代小鼠进行Vash2基因PCR电泳检测，结果如图2所示．A、B、C三种小鼠中代表Vash2基因敲除纯合子的是A，这种类型的小鼠在F2代中的比例理论上为25%．
| A． | 二氧化碳和葡萄糖 | B． | 水和三碳化合物 | ||
| C． | 水和葡萄糖 | D． | 丙酮酸和三碳化合物 |
LB液体培养基和LB固体培养基是微生物实验室中较常用的一种培养基，其配方为10g蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠等，主要用于培养细菌、扩增菌种数量．某研究组开展了氧气对微生物生长、繁殖的影响实验，请回答下列问题：| A． | DNA复制 | B． | 基因突变 | C． | 翻译 | D． | 转录 |