题目内容

6．Vash2基因在肝癌、卵巢癌、乳腺癌等组织中表达程度较高，有促进肿瘤血管生成的作用．为研究其具体作用机制，研究者应用Cas9/sgRNA系统构建了Vash2基因敲除的小鼠模型，该系统作用机理如图1所示．

（1）Cas9系统最早在细菌体内发现，是细菌用来抵御噬菌体DNA等外源DNA片段入侵而建立的机制，相当于人类的免疫系统．
（2）为敲除Vash2基因，需要设计sgRNA（单链向导RNA），由图可知，sgRNA的一段序列能与Vash2基因进行碱基互补配对．研究者通过显微注射技术将sgRNA和Cas9mRNA导入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引导由Cas9mRNA通过翻译过程产生的Cas9酶在配对区域定点剪切，使Vash2基因片段Ⅱ（填图中罗马数字）发生缺失从而导致基因突变．
（3）被敲除基因的鼠经胚胎移植，最后获得44只F0代小鼠，经PCR检测和基因测序，从中选出1号、3号、5号、39号为阳性高效敲除小鼠．由于是随机敲除，导致不同个体丢失的基因片段大小不同，具体情况见表
编号敲除的总片段长度（bp）敲除的有效片段长度（bp）
1（♂）169169
3（♂）196196
5（♀）429268
39（♀）483200
尽管得到的四只小鼠都是纯合子，但由于丢失片段不同，通常F0代小鼠之间不能相互交配．为了得到能稳定传代的Vash2基因敲除纯合子，研究者从上表中选择5号小鼠和野生雄性鼠交配，得到F1代Vash2杂合子．选择5号小鼠的原因是：5号小鼠敲除的有效片段长度较大．
（4）F1代小鼠相互交配得到F2代，将F2代小鼠进行Vash2基因PCR电泳检测，结果如图2所示．A、B、C三种小鼠中代表Vash2基因敲除纯合子的是A，这种类型的小鼠在F2代中的比例理论上为25%．

分析 根据题意和图示分析可知：敲除基因时，sgRNA与Vash2基因的部分序列互补配对，细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起Vash2基因发生碱基对缺失，导致基因突变．该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用类似于限制酶的作用，敲除后需要DNA连接酶对DNA上的切口进行修复．

解答 解：（1）细菌内的Cas9系统可抵御噬菌体DNA等外源DNA片段入侵，相当于人类的免疫系统，对自身起保护作用．
（2）据图可知，sgRNA的一段序列能与Vash2基因进行杂合，说明两者之间进行碱基互补配对．小鼠属于动物，所以研究者可通过显微注射技术将sgRNA和Cas9mRNA导入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引导由Cas9mRNA通过翻译过程产生的Cas9酶在配对区域定点剪切，使Vash2基因片段Ⅱ发生缺失，碱基对减少，从而导致基因突变．
（3）根据题意和图表分析可知：在1号、3号、5号、39号中，5号小鼠（♀）敲除的有效片段长度较大，为268bp，所以可选择5号小鼠和野生雄性鼠交配，得到F1代Vash2杂合子．
（4）将F2代小鼠进行Vash2基因PCR电泳检测，A中没有Vash2标识序列，说明其代表Vash2基因敲除纯合子．由于F1代小鼠相当于杂合子，所以这种类型的小鼠在F2代中的比例理论上为25%．
故答案为：
（1）免疫
（2）进行碱基互补配对        显微注射     翻译Ⅱ
（3）野生雄性      5号小鼠敲除的有效片段长度较大
（4）A      25%

点评 本题以“基因敲除”为题材，考查了基因工程以及基因分离定律的有关知识，要求考生能够根据实验表格数据得出相应的实验结论，能够根据敲除过程图解明确敲除的本质，并能够利用测交实验对敲除实验结果进行验证，具有一定的难度．

练习册系列答案
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