Question

15．普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种（过程如图甲所示）．

（1）图甲中，过程①需要的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶．为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以淀粉作为唯一碳源．
（2）某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示．该同学的接种方法是稀释涂布平板法；推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀．
（3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种工程酵母菌的发酵罐需要先排气，其原因是工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO₂的速率更快．
（4）在酵母菌培养实验中需每天定时对酵母菌细胞进行取样计数，请回答以下问题：
①取出的样液中需立即加入固定液，其目的是维持细胞数量不变．
②在计数前通常需要将样液稀释，这是因为细胞密度过大．
③将样液稀释100倍，采用血球计数板（规格为1mm×1mm×0.1mm）计数，观察到的计数室中细胞分布见图丙，则培养液中酵母菌细胞的密度是1×10⁸  个/mL．

Answer 1

分析 分析图甲：图甲是将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种的过程．图中①表示基因表达载体的构建过程；②、③过程重复几次的目的是纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌．
分析图乙：图乙是一个平板经培养后的菌落分布，可见其采用的是稀释涂布平板法，但图中群落分布相对较集中．
分析图丙：探究酵母菌种群数量的变化实验中，实验流程为：（1）酵母菌培养（液体培养基，无菌条件）→（2）振荡培养基（酵母菌均匀分布于培养基中）→（3）观察并计数→重复（2）、（3）步骤（每天计数酵母菌数量的时间要固定）→绘图分析．

解答 解：（1）图甲过程①表示基因表达载体的构建，该过程先要用同种限制性核酸内切酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来形成重组质粒．普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，而工程酵母菌可以高效利用淀粉，所以用以淀粉为唯一碳源的选择培养基可以选出工程酵母菌．
（2）由图乙可知，该同学采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好的分散开来，可能是涂布不均匀导致的．
（3）普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，而工程酵母菌可以高效利用淀粉，即将淀粉分解产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵速率快，产生二氧化碳的速率更快，所以接种工程酵母菌的发酵罐要先排气．
（4）①取出样液前，应先振荡摇匀，使酵母菌分布均匀，然后再取样；取出的样液中需立即加入固定液，以维持细胞数量不变．
②若酵母菌细胞密度过大，则不易计数，因此计数前，通常需要将样液按一定比例稀释．
③计数时，应计四个角及中央的5个中方格中的酵母菌数目（对于边界线上的酵母菌要遵循“记上不计下、记左不计右”的原则）．因此，这5个中方格中酵母菌数量=5（左上）+4（右上）+3（中间）+4（左下）+4（右下）=20个，则1mm×1mm×0.1mm培养液中酵母菌的数量为20×5×100（稀释的倍数）=10000个，那么1mL培养液中酵母菌细胞数目为10000×$\frac{1mL}{0.1m{m}^{3}}$=10000×10000=1×10⁸个．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶　  淀粉
（2）稀释涂布平板法　     涂布不均匀
（3）工程酵母　 工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO₂的速率更快
（4）①维持细胞数量不变      ②细胞密度过大      ③1×10⁸

点评 本题以工程菌为素材，结合图表综合考查基因工程、微生物的实验室培养、果酒制作、培养液中酵母菌数量的变化，要求考生识记基因工程的工具及操作步骤；识记微生物的接种方法，能根据图乙判断接种方法及图乙现象出现的原因；能根据图中信息推断酵母菌的种群密度，属于考纲理解和应用层次的考查．