Question

血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O₂和部分CO₂的运输．请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题．
（1）将实验流程补充完整：A为

 

，B为

 

．凝胶色谱法的基本原理是根据而达到蛋白质分离的有效方法．
（2）洗涤红细胞的目的是去除

 

，洗涤次数过少，无法除去；离心速度过高和时间过长会使一同沉淀．达不到分离的效果．洗涤干净的标志是．释放血红蛋白的过程中起作用的是

 

．
（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是

 

．如果红色区带，说明色谱柱制作成功．
（4）图为填充的凝胶色谱柱，据图回答以下问题：
①自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构由

 

替代．
②装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是

 

．
③洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体

 

（填“相同”或“不同”），洗脱时，对洗脱液的流速要求是

 

．

Answer 1

考点：蛋白质的提取和分离

专题：

分析：1、血红蛋白的提取与分离的实验步骤主要有：（1）样品处理：①红细胞的洗涤，②血红蛋白的释放，③分离血红蛋白．（2）粗分离：①分离血红蛋白溶液，②透析．（3）纯化：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质．（4）纯度鉴定--SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳．
2、据图分析：A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱．

解答： 解：（1）样品处理过程为：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析，所以A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱．凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢．
（2）洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，释放血红蛋白的过程是让红细胞吸水胀破．如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因．此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度．重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净．由于甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂．
（3）磷酸缓冲液（pH为7.0）能够准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致．如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关．
 （4）①制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构由尼龙网和尼龙纱替代．
②由于气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，所以装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在．
③洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动，对洗脱液的流速要求是保持稳定．
故答案为：
（1）血红蛋白的释放    样品的加入和洗脱   相对分子质量的大小
（2）杂蛋白（血浆蛋白）   血浆蛋白    白细胞和淋巴细胞   离心后的上清液中没有黄色     蒸馏水和甲苯
（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致    均匀一致的移动
（4）①尼龙网和尼龙纱
②气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
③相同   保持稳定

点评：本题主要考查血红蛋白的提取和分离过程，意在强化学生对相关实验操作流程的识记、理解与运用．