4．胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。

　　 (1)判断某人患糖尿病的主要方法有________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　　 (2)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？________________________________________________________________________，

　　 为什么？________________________________________________________________________。

　　 (3)为使过程⑧更易进行，可用________处理D的细胞壁。D细胞一般选用大肠杆菌或枯草杆菌的原因是________________________________________________________________________。

　　 (4)下图A-D段表示质粒的某片段，若B表示启动子，为使目的基因直接表达，目的基因C插入的最佳位点是图中的________处(填数字序号)。

　　 (5)根治糖尿病的最佳方法是________。

　　 (6)基因工程其他方面的应用，如被用于培育转胰蛋白酶抑制剂基因的蔬菜，但若对该蔬菜处理不当，可能给人体带来的负面影响是________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　　 解析：(1)糖尿病患者空腹时的血糖浓度持续高于160-180 mg/dL，且尿液中含有糖。

(2)胰岛素基因的表达只在胰岛B细胞内，人皮肤细胞内虽有胰岛素基因，但不表达。(3)过程⑧是将目的基因导入大肠杆菌中，可用Ca²⁺处理受体细胞，使之处于感受态。大肠杆菌、枯草杆菌繁殖速度快，目的基因表达迅速，故作受体细胞。(4)启动子位于基因的首端，以驱动基因转录出mRNA。(5)通过基因治疗可根治糖尿病。(6)转胰蛋白酶抑制剂基因的表达产物胰蛋白酶抑制剂可能会抑制人胰蛋白酶活性，从而影响食物的消化。

　　 答案：(1)空腹时的血糖浓度持续高于160-180 mg/dL，或尿液中有糖　(2)不能　皮肤细胞中的胰岛素基因不表达，不能形成胰岛素mRNA　(3)CaCl₂(或Ca²⁺)　繁殖速度快，目的基因表达迅速　(4)③　(5)基因治疗　(6)胰蛋白酶抑制剂会抑制人的胰蛋白酶的活性，影响食物蛋白的消化

3．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：

　　 (1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________。

　　 (2)通过DNA合成形成的新基因应与________结合后转移到____________________中才能得到准确表达。

　　 (3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有______________、________和发酵工程。

　　 (4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？

　　 ________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　　 (5)下列关于蛋白质工程的说法，错误的是(　)

　　 A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要

　　 B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构

　　 C．蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子

　　 D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又称为第二代基因工程

　　 解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是胰岛素的预期功能。(2)合成的目的基因应与载体构建基因表达载体后导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，形成目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程来生产基因产物，并且在生产过程中要借助工程菌，所以还需要进行发酵，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中氨基酸的序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列。然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。(5)由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造基因来完成，而不是直接对蛋白质分子进行操作。

　　 答案：(1)蛋白质的预期功能　(2)载体　大肠杆菌等受体细胞　(3)蛋白质工程　基因工程

　　 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因　(5)B

2．依据基因工程技术有关原理回答下列问题：

　　 (1)限制性内切酶是在基因工程中用来切开DNA的酶，EcoRI是大肠杆菌的R型菌体分离而来的限制性内切酶，它总是在一定的碱基序列中切断DNA。以下的碱基序列表示的是EcoRI的识别序列，请用箭头在下图中画出EcoRI的作用部位：

　　 (2)获取目的基因途径有生物体内提取或________。

　　 (3)下图是将人类的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用的载体为质粒A。已知细菌B内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：

　 ①简述重组质粒的主要过程________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　 ②导入细菌B细胞的目的基因成功表达的标志是________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　　 (4)假如预期到某种酶的功能，要设计相应的基因，下列图示中：

　 ①是____________；②是_______________________________________________。

　　 答案：(1) G↓A　A　T　T　C

　　　　　　　 C　T　T　A　A↑G　

　　 (2)人工合成

　　 (3)①用特定的限制性内切酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口；用同种限制性内切酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒　②受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素

　　 (4)①分子设计　②具有一定氨基酸序列的多肽链

　 ▲科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株--抗虫棉。其过程大致如图所示：

　　 根据题意回答下列问题：

　　 (1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是__________________、____________________、____________________、______________________。

　　 (2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA________________________________________的特点。

　　 (3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是____________________________。

　　 (4)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是______________________________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________________________________________________________________________。

　　 答案：(1)目的基因的获得　重组载体的构建　重组载体的导入和筛选　目的基因的表达与鉴定

　　 (2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上　(3)农杆菌转化法　(4)目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上　DNA分子杂交技术

1．如图表示从苏云金芽孢杆菌分离出杀虫晶体蛋白基因(简称Bt基因)及形成转基因抗虫植物的图解。

　　 请回答：

　　 (1)在下列含有ATP和有关的酶的试管中，大量而快捷的获取Bt基因的最佳方案是下图中的(　)

　　 (2)写出b过程表达式：________________________________________________________________________

　　 ________________________________________________________________________。

　　 (3)科学家计划从哺乳动物的乳汁中提取某种抗体，应将控制抗体合成的基因导入该种动物的________________中，导入基因成功表达的标志是__________________。

　　 (4)在我国“863”计划资助下开展Bt抗虫棉育种等研究，这将对________、________和农业可持续发展产生巨大影响。

　　 解析：应用基因工程技术，从苏云金芽孢杆菌中提取杀虫晶体蛋白基因(目的基因)导入棉花细胞中形成转基因抗虫棉，Bt基因的表达使棉花细胞中合成了原毒素，使采食棉花的昆虫中毒死亡。要使某种动物的乳汁中含有某种抗体，目的基因一般导入受精卵中。这样，由此受精卵发育成的哺乳动物的所有体细胞中都含有目的基因。

　　 答案：(1)D(2)Bt基因mRNA原毒素(晶体蛋白)

　　 (3)受精卵　动物乳汁中含此种抗体　(4)农业害虫防治　环境保护

10．我国科研人员发现，弯曲的蚕丝由于弯折处易断裂，其强度低于由蜘蛛纺绩器拖牵丝的直丝，并首次在世界上通过了转基因方法将“绿色荧光蛋白基因”与“蜘蛛拖牵丝基因”拼接后成功插入蚕丝基因组中，并在受体细胞中成功表达。

　　　 (1)在这项“基因工程”的操作中，目的基因是________，采用绿色荧光蛋白基因的主要目的是__________。

　　　 (2)两基因组合在导入受体细胞前必须进行的步骤是：将其与由细菌体内取得的________进行切割处理，以保证有相同的____________，并拼接成____________。如果引入的受体细胞是细菌，还要对细菌作__________处理。

　　　 (3)在基因工程中受体常用微生物，为什么？________________________________________________________________________。

　　　 (4)“蜘蛛拖牵丝基因”成功表达的标志是____________________________________________。

　　　 (5)带有“绿色荧光蛋白基因”的转基因蚕，是否能引起生态安全性问题？请分析原因。

　　　 ________________________________________________________________________。

　　　 解析：从题目提供的信息不难看出，蜘蛛纺绩器拖牵丝的直丝强度比蚕丝要大，所以拖牵丝基因是目的基因，绿色荧光蛋白基因是作为标记的基因。在形成重组DNA时，首先要用同一种限制性内切酶切割目的基因和质粒，得到相同的黏性末端，再用DNA连接酶形成重组质粒，如果要将重组质粒导入细菌体内，必须对细菌细胞壁用氯化钙处理，增加其通透性，便于重组质粒进入细菌体内。蜘蛛拖牵丝基因成功表达时，能产生高强度的丝，转基因生物的安全性问题正在探索中。

　　　 答案：(1)拖牵丝基因　作为标记(基因)　(2)质粒　黏性末端　重组质粒(或重组DNA)　CaCl₂(或提高膜的通透性)　(3)微生物的繁殖速度快　(4)产生高强度的丝　(5)可能。转基因蚕扩散进入自然生态系统，与同种的野生蚕杂交后，使野生蚕也含有转基因，可能会威胁到原有物种，引起生态危机

9．将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

　　　 表1引物对序列表

　　　 表2　几种限制性内切酶识别序列及切割位点表

　　　 请根据以上图表回答下列问题。

　　　 (1)在采用常规PCR技术扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是________________________________________________________________________。

　　　 (2)PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？________________________________________________________________________。

　　　 (3)图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？

　　　 __________________。

　　　 (4)为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为________。

　　　 (5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

　 ①采用EcoRI和Pst I酶切，得到________种DNA片段。

　 ②采用EcoRI和SmaI酶切，得到________种DNA片段。

　　　 解析：(1)PCR技术扩增目的基因的过程中使用的DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶，其特点是耐高温。

　　　 (2)分析表1可知，引物对A中AT数量明显多于GC，引物对B中GC数量明显多于AT，因此引物对B与模板结合更稳定。连接GC对的是三个氢键，连接AT对的是两个氢键。引物对A中AT多，引物对B中GC多，引物对B与模板链之间形成的GC碱基对也多，打开碱基对时，引物对B比引物对A消耗的能量多，因而需要较高的退火温度。

　　　 (3)DNA连接酶没有特异性。

　　　 (4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。

　　　 (5)分析图1和表2，我们可获得下列信息：抗原基因DNA经①过程，被EcoR I切割得一黏性末端(X端)，被Alu I切割得一平末端(Y端)。载体质粒DNA分子经②过程，被EcoR I切割得一黏性末端(M端)，被Sma I切割得一平末端(N端)。经过程③，目的基因与载体DNA连接在一起，要注意的是X端与M端结合后，其碱基序列仍为EcoR I的识别序列，Y与N端结合后，其碱基序列既不是Alu I的识别序列，也不是Sma I的识别序列。在M、N之间有一个Pst I的切割位点。也就是说，重组质粒T中有EcoR I和Pst I两种酶的切割位点，而没有 Sma I和Alu I的切割位点。因而采用EcoR I和Pst I酶切，可得到两种DNA片段，采用EcoR I和Sma I酶切，只得到一种DNA片段。

　　　 答案：(1)耐高温　(2)引物对B　(3)否　(4)农杆菌　(5)①2　②1

8．为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。

　　　 (1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的________处，DNA连接酶作用于________处。(填“a”或“b”)

　　　 (2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和________法。

　　　 (3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用________技术，该技术的核心是________和________。

　　　 (4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的________作探针进行分子杂交检测，又要用________方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。

　　　 解析：本题以“科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系”为背景，考查基因工程和植物细胞工程的基本内容。基因工程中的工具酶--限制酶和DNA连接酶的作用是断开或连接两核苷酸间的磷酸二酯键。将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。目的基因的检测与鉴定，常利用DNA分子杂交技术(探针)等作分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。植物组织培养的基本过程是植物在离体状态下，进行脱分化与再分化。

　　　 答案：(1)a　a　(2)基因枪(或花粉管通道)　(3)植物组织培养　脱分化(去分化)　再分化

　　　 (4)耐盐基因(目的基因)　一定浓度盐水浇灌(或移栽到盐碱地中)

7． (2009·银川一中测试)2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家马里奥·R·卡佩奇和奥利弗·史密西斯、英国科学家马丁·J·埃文斯，奖励他们创造了一套完整的“基因敲除小鼠”的方式。所谓“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰，即将胚胎干细胞中的某基因改掉，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过，则它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠。据所学知识回答下列问题：

　　　 (1)切割目的基因时，如上图所示，该限制酶能识别的碱基序列是________，切点在________之间。

　　　 (2)将目的基因转入小鼠胚胎干细胞后，胚胎干细胞能够发育成转基因小鼠，所依据的生物学原理是________。胚胎干细胞在体外培养的条件下可以增殖而不发生________，但通过体外定向诱导，能培育出人造________。

　　　 (3)从胚胎干细胞转化到获得目的基因纯合子，并配合基因检测，最少需要代。育种过程是：检测目的基因→________→从中选出目的基因纯合的个体。

　　　 (4)基因敲除技术中存在着一个难以克服的缺陷：敲除了某个基因后，可能不会产生容易识别的表型改变，因此就不能获知该基因的功能，请你分析原因：________________________________________________________________________。

　　　 解析：本题以新信息为载体考查基因工程的操作及其应用。(1)限制酶识别的碱基序列为回文序列，两条链的序列正好相反。由题图可知，限制酶识别的碱基序列为GAATTC，且在G和A之间切开。(2)胚胎干细胞发育成个体，体现了动物细胞的全能性；胚胎干细胞在体外培养条件下一般不发生分化，但在一定诱导条件下，可以定向分化形成一定的组织或器官供移植所用。(3)基因工程育种过程为：检测目的基因→选择目的基因进入生殖细胞的个体交配 (第一代)→从中选出目的基因纯合的个体(第二代)，所以如果配合基因检测，共需要两代。(4)因基因和性状之间的关系并不是一一对应的关系，有的性状是由多对基因控制，有的基因之间可以互补，敲除了某个基因后，可能产生不易识别的表型改变，因此就不能获知该基因的功能。

　　　 答案：(1)GAATTC　G和A　(2)细胞全能性　分化　组织或器官　(3)2　选择目的基因进入生殖细胞的个体交配　(4)许多基因在功能上是多余的，敲除后，其他基因可以提供同样的功能

6．(2010·山东省潍坊市光华中学高三月考)已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下：

　　　 (1)实验步骤①所代表的反应过程是________________________________________________________________________。

　　　 (2)步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用________________________________________________________________________。

　　　 (3)如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能________，也不能______________。

　　　 (4)为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用________与________进行抗原-抗体特异性反应实验，从而得出结论。

　　　 (5)步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________(填“相同”或“不同”)，根本原因是________________________________________________________________________。

　　　 解析：本题考查基因工程的工具及操作步骤和学生识图能力。(1)图中①RNA→DNA表示通过逆转录方式获得目的基因。(2)基因表达载体构建时，需要利用限制酶对载体和目的基因进行剪切，形成黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组载体。(3)目的基因导入受体细胞后，需要借助于载体在受体细胞中进行复制而扩增目的基因，从而获得大量的表达产物，而直接导入则容易被受体细胞中的DNA水解酶所水解，导致得不到表达产物。(4)S蛋白为SARS病毒表面主要的病毒抗原，因此用抗原-抗体特异性反应实验可检测其是否具有同样的抗原性。(5)步骤④和⑥相比，基因相同，只是导入的受体细胞的种类不同，因为真核生物和原核生物共用一套密码子，所以表达产物相同。

　　　 答案：(1)逆转录　(2)限制性内切酶和DNA连接酶　(3)复制　合成S基因的mRNA(或转录)　(4)大肠杆菌中表达的S蛋白　SARS康复病人血清　(5)相同　表达蛋白质所用的基因相同

5．图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：

　　　 (1)在基因工程中，A表示________，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是________，B表示________。

　　　 (2)B→D的过程中，若使用的棉花受体细胞为体细胞，⑤表示的生物技术是________。要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程： _________________________________

　　　 ________________________________________________________________________

　　　 ________________________________________________________________________。

　　　 解析：(1)图中A、B分别表示目的基因、重组DNA；根据酶的专一性特点，①过程使用的酶是限制性核酸内切酶，其能够识别特定的脱氧核苷酸序列。(2)B→D的过程是转基因植物的培育过程，其需要的生物技术是植物组织培养；在检测转基因棉花中的抗虫基因(目的基因)是否表达时，可让害虫吞食转基因棉花的叶子，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状。

　　　 答案：(1)目的基因　能够识别特定的脱氧核苷酸序列　重组DNA　(2)植物组织培养　让害虫吞食转基因棉花的叶子，观察害虫的存活情况，以确定转基因棉花是否具有抗虫性状