【题目】鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子,广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因,构建基因表达载体,通过农杆菌介导法导入烟草,以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程,表示相关的操作,两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题:

1)步骤中,利用PCR技术扩增干扰素基因时,设计引物序列的主要依据是__________的特定碱基排列顺序。科研人员还在两种引物的一端分别加上了_____________________(填DNA序列),以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用两种限制酶,选择的原则是_________

ATi质粒内,限制酶的切割位点应位于T-DNA

B.目的基因编码蛋白质的序列中,每种限制酶只有一个切割位点

C.酶切后,目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D.酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

2)步骤所构建的基因表达载体中未标注出的元件还可以有____________,步骤中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

3)步骤中,科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后,先通过_________获得DNA,再进行PCR扩增,若最终未能检测出干扰素基因,其可能原因是_____________________________________________________

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