13.下面是将乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料,请分析回答下列问题.
资料1:巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源,同时AOX1基因(醇氧化酶基因)受到诱导而表达,5'AOX1和3'AOXl(TT)是基因AOX1的启动子和终止子,此启动子也能使外源基因高效表达.
资料2:巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒,下图为科学家改造的pPIC9K质粒,其与目的基因形成的重组质粒在特定部位酶切后形成的重组DNA片段可以整合到酵母菌染色体上,最终实现目的基因的表达.

(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组,应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠAvrⅡ限制酶识别序列(SnaB I、Avr II、SacI、Bgl II四种限制酶的识别序列均不相同),这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化.
(2)酶切获取HBsA9基因后,需用DNA连接酶将其连接到pPIC9K质粒上,形成重组质粒,根据步骤②可知步骤①将重组质粒先导入大肠杆菌的目的是导入大肠杆菌体内,目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度,短时间内可获取大量的重组质粒..
(3)步骤3中应选用限制酶BglⅡ来切割从大肠杆菌分离的重组质粒从而获得图中所示的重组DNA片段,然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞.
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功,在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选.
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后,需要向其中加入甲醇以维持其生活,同时诱导HBsA9基因表达.
(6)与大肠杆菌等细菌相比,用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞,其优点是在蛋白质合成后,细胞可以对其进行加工(修饰)并分泌到细胞外,便于提取.
(7)培育转化酵母细胞所利用的遗传学原理是基因重组.
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