Question

19．植酸酶能提高饲料中磷的利用率，减少磷随畜禽粪便排出量，进而降低环境污染． 科学家试图将黑曲霉植酸酶基因（phyA）转入猪细胞中，以培育出转植酸酶基因猪．如图为实验过程中基因表达载体的构建过程，图中A、A1，B、B1表示引物，NheⅠ（G^↓CTAGC），XhoⅠ（G^↓TCGAG）为限制酶．请问答．

（1）实验室通用是利用从黑曲霉细胞中提取的RNA，再通过反（逆）转录等技术形成 phyA对应的cDNA，从基因结构分析，这一cDNA比黑曲霉细胞中的phyA少启动子、终止子等结构．
（2）由图可知，科学家首先将黑曲霉植酸酶基因phyA与猪腮腺分泌蛋白基因信号肽基因 （ps）拼接在一起，其目的是使phyA基因能够在腮腺细胞中特异、高效地表达．实验室中，过程②（解链）一般可通过加热的方法完成，利用引物AI和BI的一端有部分碱基序列可以互补配对将这两个DNA片段连接起来．
（3）限制酶X ho I切割DNA形成的黏性末端可以表示为-AGCT．过程④中同时利用Nhe I酶和Xho I酶处理目的基因和运载体，其主要优点是可保证目的基因定向插入运载体中，保证目的基因能够正确表达．
（4）研究中需要将重组质粒导入受精卵，再运用胚胎工程技术培育获得转基因猪，选取这类细胞作为目的基因的受体细胞的主要依据是动物受精卵具有全能性．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）以RNA为模板合成DNA的过程称为逆 （反）转录；由于mRNA是以基因中编码蛋白质的片段为模板，利用碱基互补配对合成的，因此cDNA中没有启动子、终止子等结构．
（2）由于不同组织细胞中选择性表达的基因不同，因此，为使植酸酶基因能在腮腺细胞中特异、高效地表达，通常将植酸酶基因插到腮腺分泌蛋白基因的启动子后．实验室中DNA解旋（如PCR）通常采用加热的方法实现，再利用引物AI和BI的一端有部分碱基序列可以互补配对将这两个DNA片段连接起来．
（3）限制酶XhoⅠ的识别序列及切割位点为：-G^↓TCGAG-，因此限制酶X ho I切割DNA形成的黏性末端可以表示为-AGCT；过程④中同时利用Nhe I酶和Xho I酶处理目的基因和运载体，这样可以防止目的基因与运载体反向连接，保证目的基因定向插入运载体中，保证目的基因能够正确表达．
（4）由于动物体细胞的全能性受到限制，因此，一般动物基因工程的受体细胞选择受精卵（受精卵的全能性最高）．
故答案为：
（1）反（逆）转录    启动子、终止子
（2）使phyA基因能够在腮腺细胞中特异、高效地表达       加热     引物AI和BI的一端有部分碱基序列可以互补配对
（3）-AGCT     可保证目的基因定向插入运载体中，保证目的基因能够正确表达
（4）受精卵    动物受精卵具有全能性

点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合图中信息准确答题．