5.人的内皮抑素(一种蛋白质)能诱导血管内皮细胞凋亡,进而抑制新血管的产生.临床上通过静脉注射含有内皮抑素基因的腺病毒感染肿瘤细胞,使肿瘤细胞产生并释放内皮抑素,抑制新生血管的形成,使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导其凋亡.
回答下列问题:
(1)从肝细胞中提取总mRNA,利用逆转录酶合成cDNA(或DNA),根据内皮抑素基因的核苷酸序列(或序列、碱基序列、碱基对序列或脱氧核苷酸序列)设计并合成引物,利用PCR技术得到大量内皮抑素基因.
(2)在构建含内皮抑素基因的腺病毒并导人受体细胞的过程中,以限制酶(或限制性核酸内切酶)和DNA连接酶作为工具酶,以腺病毒作为载体.
(3)在进入临床使用前,需用体外培养的血管内皮细胞进行生理、病理检测.为获得大量的血管内皮细胞,首先用胰蛋白(或胶原蛋白)酶处理血管内皮组织,使其分散成单个细胞,制成细胞悬液,然后将其放人含血清、血浆等一些天然成分的合成培养基中培养.
(4)血管内皮细胞被重组腺病毒感染后,若通过抗原一抗体杂交方法检测呈阳性并观察到细胞凋亡,则说明内皮抑素基因得到表达且具有生物学活性.
(5)临床上将含内皮抑素基因的腺病毒通过静脉注射感染肿瘤细胞,使肿瘤生长受到抑制,这种治疗方法属于体内(填“体内”或“体外”)基因治疗.
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