Question

19．小立碗藓是一种苔藓植物，易培养，被广泛应用于生物学实验研究，又因其同源重组的效率很高，已成为研究基因功能的良好材料．请回答下列问题：
（1）甲同学在使用高倍镜观察小立碗藓的叶绿体时，发现在适宜条件下细胞中的叶绿体长时间静止不动，最可能的原因是细胞已死亡．
（2）乙同学用小立碗藓进行了如下实验操作：
步骤一：在洁净的载玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗藓的小叶，盖上盖玻片．
步骤二：从盖玻片一侧滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次．
步骤三：在显微镜下观察，若发现叶绿体向细胞中间聚拢，说明细胞已发生质壁分离．
（3）同源重组在细胞中可自然发生，交叉互换的位点必须发生在特定的同源序列中，原理如图1所示．已知由硫酸盐降解酶（K基因编码）催化某种硫酸盐（APS）的降解是高等植物中硫酸盐利用的关键步骤．有人提出，植物体中还存在着该硫酸盐降解的支路（PAPS），但不能确定其相关酶是否在植物体中存在．科研人员利用小立碗藓进行了以下研究：
①测定K基因两侧的碱基序列．若测得在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中含有一个6个碱基对的限制酶SmaⅠ的识别序列，可推知该酶的识别序列为CCCGGG．
②质粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因）和限制酶SmaⅠ、TthⅢ和BsmⅠ的酶切位点，如图2所示．为了使Neo基因能与K基因发生同源重组，应选用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ将Neo基因从质粒上切下来，然后在该基因的两侧增加与K基因两侧相同的同源序列，构建具有Neo基因的表达载体．
③制备小立碗藓的原生质体，将其放在等渗溶液中，利用聚乙二醇介导直接将Neo基因表达载体导入小立碗藓细胞内．
④在添加了新霉素的培养基中培养上述小立碗藓细胞，若能够发育成完整的植物体，则表明该植株已没有K基因．若通过此转化途径得到的植株可利用硫酸盐作为唯一硫源，说明在小立碗藓中存在PAPS支路．

Answer 1

分析 分析题意可知，观察质壁分离时，需用活细胞，用引流法替换为蔗糖溶液后，可观察到质壁分离现象；为了使Neo基因能与K基因发生同源重组，选用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ将该基因切下来，然后在该基因的两侧增加与基因M两侧相同同源序列的碱基，构建具有抗性基因载体．质粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因），故应在添加了新霉素的培养基中培养植物细胞，进行筛选．该实验的目的是研究植物体中还存在着该硫酸盐降解的支路，故应在添加了新霉素的培养基中培养上述小立碗藓细胞，若能够发育成完整的植物体，则表明该植株已没有K基因．若通过此转化途径得到的植株可利用硫酸盐作为唯一硫源，说明在小立碗藓中存在PAPS支路．

解答 解：（1）活细胞中叶绿体会随细胞质流动而运动，若发现在适宜条件下细胞中的叶绿体长时间静止不动，最可能的原因是 细胞已死亡．
（2）乙同学用小立碗藓进行了如下实验操作：
步骤一：制片观察，在洁净的载玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗藓的小叶，盖上盖玻片．
步骤二：用引流法替换为蔗糖溶液，即从盖玻片一侧滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次．
步骤三：在显微镜下观察，细胞失水后会发生质壁分离，原生质层会向中央聚拢，故若发现叶绿体向细胞中间聚拢，说明细胞已发生质壁分离．
（3）①由于限制酶SmaⅠ的识别序列为回文序列，故可推知在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中该酶的识别序列为 CCCGGG．
②为了使Neo基因能与K基因发生同源重组，选用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ将该基因从质粒上切下来，然后在该基因的两侧增加与基因M两侧相同同源序列的碱基，构建具有抗性基因载体．
③去除植物细胞壁采用酶解法，用纤维素酶和果胶酶处理细胞，得到原生质体．为防止原生质体吸水涨破，应在等渗或微高渗溶液中用PEG做促溶剂，将Neo基因载体导入小立碗藓细胞内．
④该实验的目的是研究植物体中还存在着该硫酸盐降解的支路，故应在添加了新霉素的培养基中培养上述小立碗藓细胞，若能够发育成完整的植物体，则表明该植株已没有K基因．若通过此转化途径得到的植株可利用硫酸盐作为唯一硫源，说明在小立碗藓中存在PAPS支路．
故答案为：
（1）细胞已死亡　
（2）用吸水纸吸引　细胞已发生质壁分离
（3）①CCCGGG　
②SmaⅠ和BsmⅠ同源序列　
③等渗
④新霉素　可利用硫酸盐作为唯一硫源

点评 本题主要考查细胞观察、基因工程、构建基因表达载体的相关知识，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中．