Question

20．扩增多个目的基因用PCK技术．如图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：

（1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal、氨苄青霉素．
（2）用图中的限制酶切割目的基因和质粒，不能（填“能”或“不能”）实现目的基因与质粒的定向连接？原因是BamHI和BgⅡ两种限制酶切得黏性末端相同．
（3）将若干个质粒和目的基因用BamHI和BgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamH I和EcoR I切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为1.8kb（已知目的基因的长度大于1kb，lkb=1000个碱基对）．
（4）PCK技术中所用的引物是根据目的基因 的一段核苷酸序列合成的．如表是用于扩增A、B、C三种基因的引物：

A基因	引物1	5′GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3′
	引物2	5′GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3′
B基因	引物1	5′TGAATCCTGTTGCCGGTCTT3′
	引物2	5′AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC3′
C基因	引物1	5′CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3′
	引物2	5′GCGTCATGATCGGCTCGATG3′

据表分析，引物特异性主要表现在核苷酸的数目不同、序列不同；每个基因对应的引物1和引物2之间不能互补配对．
（5）PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是使引物与模板链相应序列互补结合．

Answer 1

分析 1、根据题意和图示1、2分析可知：质粒中，氨苄青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都属于标记基因，目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，质粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ两种酶的酶切位点．一般为了防止目的基因和质粒反向连接，用两种限制酶切割目的基因和质粒．
2、PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术．
（1）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物．
（2）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
（3）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．

解答 解：（1）由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp为氨苄青霉素抗性基因，所以若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素．
（2）由于BamHI和BgⅡ两种限制酶切得黏性末端相同，不能实现目的基因与质粒的定向连接．
（3）根据BamHⅠ和BlgⅡ两种酶识别的序列为G↓GATCC、A↓GATCT．质粒上存在BamHI的切割位点，假设用a和b表示．目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，假设分别用c和d表示．那么目的基因与质粒链接的方式可能有两种，如图所示：

用BamHⅠ切割和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四种长度的DNA片段．
①如果BamHⅠ切割ac处，可能的情况如图：

②如果BamHⅠ切割ac处，可能的情况如图，

据图比较可推断出目的基因的长度为1.8Kb．
（4）PCR扩增技术的前提是要用一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一段序列合成引物．据表中A、B、C三种基因的引物核苷酸序列分析，引物特异性是引物中特定的碱基序列和核苷酸的数目不同．每种基因扩增需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是不互补的，否则会形成引物二聚体，进而影响目的基因的扩增．
（5）PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是使引物与模板链相应序列互补结合．
故答案为：
（1）X-gal     氨苄青霉素
（2）不能     BamHI和BgⅡ两种限制酶切得黏性末端相同
（3）1.8
（4）目的基因     核苷酸的数目不同、序列不同      互补配对
（5）使引物与模板链相应序列互补结合

点评 本题结合重组质粒形成示意图和各种引物的核苷酸序列，综合考查了考查基因工程和PCR技术的相关知识，重点考查基因工程的步骤，要求考生识记基因工程的步骤，掌握重组质粒的筛选方法，能运用所学的知识，结合题图，判断导入重组质粒的大肠杆菌能否在相应的培养基中生存．