Question

5．在农业生产中发现一种广泛使用的除草剂（含氮有机化合物）在土壤中不易降解，长期使用可污染土壤．为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌（已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明）．

（1）制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理．现有1L土壤浸出液，用无菌吸管吸取1mL样液至盛有9mL无菌水的试管中，依次稀释10³稀释度．各取0.1mL已稀释10³倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液样中菌体数为5.6×10⁸．
（2）要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养皿中培养基的成分特点是在无氮培养基中添加了该除草剂．
（3）接种技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度，是研究和应用微生物的前提．在划线接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是培养基中缺少这些细菌可利用的氮源或有氧条件抑制了这些细菌的生长．
（4）在培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是氮气，有透明带菌落利用的氮源主要是该除草剂，据此可筛选出目的菌．实验结果如图2显示的A～E五种菌株中，E是最理想菌株．
（5）科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如表所示：

接种的菌种	一般培养基	实验处理及结果
A	不生长	添加营养物质甲，能生长
B	不生长	添加营养物质乙，能生长
A+B	能生长	不添加营养物质甲、乙就能生长

突变株A不能在一般培养基上生长的原因是突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶．突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供．

Answer 1

分析 1、从土壤中分离微生物的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株．
2、从土壤中分离目的菌要用固体的选择培养基，在固体培养基中，无透明带菌落利用的氮源主要是氮气；有透明带菌落利用的氮源主要是除草剂，据此可筛选出目的菌．

解答 解：（1）各取0.1mL已稀释10³倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升（1L等于10³ml）原土壤浸出液样中菌体数为$\frac{55+56+57}{3}$×10³×10⁴=5.6×10⁸．
（2）从物理性质方面来看，题图培养皿中培养基属于固体培养基；从用途方面来看，该培养皿中培养基属于选择培养基．该除草剂为含氮有机化合物，降解该除草剂的细菌可以以除草剂为氮源．故该培养基中除加入除草剂外，不再含有其他氮源，以选择出能降解该除草剂的细菌．
（3）接种技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度，是研究和应用微生物的前提．在划线接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落；培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是培养基中缺少这些细菌可利用的氮源或有氧条件抑制了这些细菌的生长．
（4）在培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是氮气，有透明带菌落利用的氮源主要是该除草剂，且透明圈越大，该细菌降解除草剂的能力越强，因此图2显示的A～E五种菌株中，E是最理想菌株．
（5）突变株A的生长依赖于营养物质甲，突变株B的生长依赖于营养物质乙．不添加营养物质甲和乙，二者混合培养时都能生长，最可能的原因是突变株A为突变株B提供了营养物质乙，突变株B为突变株A提供了营养物质甲．
故答案为：
（1）5.6×10⁸
（2）在无氮培养基中添加了该除草剂 
（3）防止杂菌污染，保证培养物的纯度        稀释获得单个菌落        培养基中缺少这些细菌可利用的氮源
（4）氮气  该除草剂       E
（5）突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶           突变株A生长需要营养物质甲，突 变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供

点评 本题考查微生物培养的实验，解答此类题目的关键是对土壤中微生物的分离与计数这个实验的熟练掌握，和在微生物实验中的无菌操作相关知识的熟练应用．