Question

11．探究如何从土壤中分离自生固氮菌并计数．
实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多．将用表层土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养．在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖．
材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9mL无菌水的大试管若干、无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱．
方法步骤：
（1）倒平板．分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在酒精灯火焰旁操作．
（2）制备土壤稀释液．取土样10g加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀．用无菌移液管吸取上清液 1mL，转至9mL无菌水的大试管中，依次稀释到10⁷倍稀释度．为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处．
（3）涂布．按照由10⁷～10³稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布3个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布1个平板．
（4）培养．放入恒温箱内，在适宜温度条件下培养3～4d．一般每隔24h统计一次，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目．
（5）细菌的计数．选取菌落数在30～300的平板进行计数．如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌株数是5×10⁷．（稀释度是10⁵）
（6）预期结果．相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数多于（填“多于”或“少于”）无氮培养基上的数目．理由是无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存．

Answer 1

分析 1．分离菌株的思路
（1）自然界中目的菌株的筛选
①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找．
②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的．
（2）实验室中目的菌株的筛选
①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度．pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长．
培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源．缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物
②方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素．配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌
2．统计菌落数目的方法
（1）稀释涂布平板法（间接）
①当样品的稀释庋足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌．
②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数．
（2）利用显微镜直接计数
3．分解尿素的细菌的鉴定细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素．
4．实验流程：土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定

解答 解：（1）倒平板应在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染．
（2）制备土壤稀释液．取土样10g加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀．用无菌移液管吸取上清液 1mL，转至9mL无菌水的大试管中，依次稀释到10⁷倍稀释度．为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰1-2cm处．
（3）按照由10¹～10⁸倍稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布3个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布1个平板做对照．
（4）培养．放入恒温箱内，在适宜温度条件下培养3～4d．一般每隔24h统计一次，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目．
（5）当菌落数目稳定时，选取茵落数在30-300的平板进行计数．如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是（稀释度是10⁵倍）5×10⁷．
（6）牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数多于无氮培养基上的数目，原因是无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存．
故答案为：
（1）酒精灯火焰旁
（2）1～2
（3）1
（4）因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（5）5×10⁷
（6）多于　 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存

点评 本题通过探究实验的过程考查微生物的培养、分离和计数等知识点，要求考生识记接种微生物常用的两种方法及相关操作；掌握微生物的计数方法，能结合所学的知识准确答题．