(三)．实验步骤-以洋葱为实验材料

1．称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。

洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

2．研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。

3．向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。

此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质--DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌(不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。

4．鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。

(二)．实验设计

1．实验材料的选取　

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

2．破碎细胞，获取含DNA的滤液　

动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

注意：

①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

3．去除滤液中的杂质　

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

注意：

①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

②方案二与方案三的原理有什么不同？

方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

4．DNA的析出与鉴定　　

将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

(一)．实验原理

提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

1．DNA的溶解性　

DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。

此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。

2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性　

蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80^oC的高温，而DNA在80^oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

3．DNA的鉴定　　

在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

(四)实验操作指导

1、无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键

①植物组织培养不同于扦插、分根、叶插等常规无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。

②无菌技术包括培养基消毒灭菌和植物材料(外植体)的消毒灭菌。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。

③对接种操作中污染情况的分析：接种3-4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。一般情况下，细菌污染可能是由接种人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严等。真菌污染可能是植物材料灭菌不当。

④妥善处理被污染的培养物：操作后常出现培养物被污染的情况。一旦发现培养材料被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。

⑤有毒药品的用后处理：外植体灭菌用过的有毒药品要妥善处理(如氯化汞等)，以免引起环境污染。

2、设置对照实验和重复组

通过设置重复组和对照组可以选出最佳的实验材料、最好的培养基配方、找出实验失败的原因。如设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作是否合格，有没有被杂菌污染。

选取适宜的材料和培养基组成是花粉植株诱导成功的关键。最适宜的花药发育时期会因植物种类和品种的不同而不同，但对大多数植物而言，适宜进行花药培养的时期是单核居中期或单核靠边期。

(二)．影响植物组织培养的因素

1、培养基配制：要严格的进行灭菌

2、外植体的选取：生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。

3、消毒　　　　　　　 4、接种　　　　 5、培养　　　　　 6、移栽和栽培：

(一)植物组织培养的原理与基本过程

1、原理：细胞全能性。

2、基本过程：外植体愈伤组织胚配装体新植物体

3、MS培养基与微生物培养基的比较

微生物培养基以有机营养为主，而MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。MS培养基中微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

4、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。

(二)．亚硝酸盐与癌症

　　亚硝胺类亚硝酸盐是最常用的一种食品添加剂，它能抑制肉毒杆菌的生长，同时保持肉色鲜嫩。它主要用于熟肉食品，如火腿、烤肉、香肠、午餐肉、腊肠、咸牛肉罐头、熏鱼、鱼罐头等，有时在腌制鱼、肉时，也使用硝酸盐作为发色剂和防腐剂。在细菌硝酸还原酶作用下，硝酸盐被还原成亚硝酸盐。亚硝酸盐本身并不致癌，但它与蛋白质代谢后产生的丰富胺类物质结合，形成亚硝胺，后者具有很强的致癌性。　硝酸盐可随饮水、进食腌制鱼肉和蔬菜进入人体。硝酸盐除作添加剂使用外，还天然存在于水和某些蔬菜，如菠菜、卷心菜。大白菜中，其含量波动很大，并受栽培方式的影响。过多地使用硝酸胺肥料，尤其在土壤缺钼的地区，都会增加作物和蔬菜中硝酸盐含量。蔬菜中的硝酸盐本身并无害，只是在口腔和胃肠道内被还原成亚硝酸盐，继而与胺类结合成亚硝胺，才产生致癌性。预防亚硝胺致癌应注意以下事项：　(1)少吃腌制、熏制肉食及其他亚硝胺或其前体物质丰富的食品尤其是孕妇和儿童，更不宜食用这些食品；　(2)腌制的鱼、肉在食用前，应在阳光下曝晒半小时，让阳光中的紫外线把亚硝胺分解掉，或再经过浸泡、冲洗；(3)勤刷牙，保持口腔卫生，减少口腔中因细菌活动可能产生的亚硝胺；　(4)维生素c具有阻止亚硝胺合成的作用，同时又是一种抗氧化剂，无毒副作用，可根据情况适量补充。

(一)．泡菜制作及亚硝酸盐含量的测定

1.制备的氢氧化铝胶体能吸附泡菜汁液中的杂质，使泡菜汁透明澄清，以便进行后续的显色反应。在实验进行过程中，

2.泡菜腌制及质量检测指标：成功制作泡菜的关键是营造无氧环境。检测指标有乳酸的含量、泡菜的风味品质，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为0.4%-0.8%，风味品质最好，因此，常以这个阶段作为泡菜的成熟期。也可以在显微镜下观察乳酸菌形态，比较不同时期泡菜坛中乳酸菌的含量。并及时对泡菜中亚硝酸盐含量进行鉴定，一般前1-4天呈上升趋势，然后逐渐下降。

3.亚硝酸盐含量的测定：配制的亚硝酸盐标准使用液与样品液显色后，目测比色效果如何，是否与标准液的浓度相吻合。如果不吻合，还应在已知浓度范围内，改变浓度梯度，进一步配制标准使用液。

(三)．注意事项

1.酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐(白坯)上的生长。发酵的温度为15-18　℃，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5　d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料(红曲、面曲、酒酿)，使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。

2.毛霉是一种低等丝状真菌，有多个细胞核，进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物，它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。