题目内容
【题目】单克隆抗体在诊断和治疗中具有广泛的应用。已知一般细胞的DNA合成途径有起始合成途径和中间合成途径两种，氨基蝶呤（A）可以阻碍起始合成途经，次黄嘌呤（H）及胸腺嘧啶核苷（T）则是中间合成途径所必需的物质。骨髓瘤细胞只有起始合成途径。在HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）。下面是制备单克隆抗体的基本步骤：
步骤1：对小鼠多次注射特定抗原，制备淋巴细胞。
步骤2：细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养。最后一次免疫后第3天制备脾细胞悬液；筛选出？途径缺失的骨髓瘤细胞，于对数生长期（又称指数生长期，即细胞以指数形式增加）制备骨髓瘤细胞悬液；取适量的脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，对它们进行诱导融合处理；用HAT培养基对处理后的细胞进行培养。
步骤3：二次筛选。
步骤4：大规模培养杂交瘤细胞，批量生产单克隆抗体。
回答下列问题：
（1）步骤1中对小鼠多次注射特定抗原的目的是________________________；实验所需淋巴细胞可由________________细胞增殖分化而来。
（2）于对数生长期制备骨髓瘤细胞悬液的原因是________________________________；为使HAT培养基上只有杂交瘤细胞可以存活，步骤2中应填________。
（3）步骤3中二次筛选可通过________________________法进行目的抗体的检测，筛选出________________细胞。
（4）在体外对杂交瘤细胞进行克隆化培养时，为维持无菌无毒的环境，应进行的操作是_______________________________________________________________________。实验发现，在杂交瘤细胞的体外培养过程中，加入饲养层细胞比不加的生长要好，可能的原因是________________________________________。
【答案】增加相应B淋巴细胞的数量 B细胞和记忆 对数期的细胞增殖速率较快 中间合成 抗原—抗体杂交 目的抗体检验呈阳性的杂交瘤（能够分泌目的抗体的杂交瘤） 对培养液和所有培养用具进行无菌处理，在培养液中加入一定量的抗生素、定期更换培养液 饲养层细胞可以产生一些促生长因子
【解析】
1.动物细胞培养条件
（1）无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害；
（2）营养物质：无机物(无机盐、微量元素等)，有机物(糖、氨基酸、促生长因子等)血清和血浆 (提供细胞生长必须的营养成份)；
（3）温度和pH(36.5±0.5℃，7.2~7.4)；
（4）气体环境(95%的空气+5%CO2的混合气体)其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定。
2.单克隆抗体制备的原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够增殖、分化形成分泌特定抗体的效应B细胞。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
（1）制备单克隆抗体的前提是首先获得效应B细胞，为了获得更多的相应的B淋巴细胞，实验中需要对小鼠多次注射特定抗原；实验所需的效应B细胞可由B细胞和记忆细胞在抗原的刺激下增殖分化而来。
（2）因为处于对数期的细胞增殖速率较快，适应新的培养环境的能力强，因此选择处于对数生长期制备骨髓瘤细胞悬液用于实验；一般细胞的DNA合成途径有起始合成途径和中间合成途径两种，而骨髓瘤细胞只有起始途径，为了将杂交瘤细胞选出来，在步骤2中应选择中间合成途径缺失的骨髓瘤细胞，在HAT培养基上杂交瘤细胞能利用效应B细胞的中间途径进行增殖。因为在HAT培养基中阻断了DNA合成的起始途径，骨髓瘤细胞以及骨髓瘤细胞自融的细胞因为起始途径被阻断而无法增殖。效应B细胞以及效应B细胞互融的细胞没有增殖能力。
（3）步骤3中二次筛的目的是要筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，通常可根据抗原抗体能够发生特异性结合的方法来检测，即用抗原—抗体杂交法进行目的抗体的检测，从而将能够分泌目的抗体的杂交瘤细胞筛选出来。
（4）动物细胞培养需要在无菌、无毒的环境中进行，因此，在体外对杂交瘤细胞进行克隆化培养时，需要对培养液和所有培养用具进行无菌处理，并同时在培养液中加入一定量的抗生素以维持无菌、无毒环境，具体培养过程中还需要定期更换培养基。实验中发现，在杂交瘤细胞的体外培养过程中，加入饲养层细胞比不加的生长要好，根据动物细胞培养的条件可知，加入饲养层细胞生长好的可能原因是饲养层细胞可以产生一些促生长因子。
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