Question

【题目】癌细胞表面蛋白“PDL-1”与T细胞表面蛋白“PD-1”特异性结合后，可抑制T细胞活性并启动其凋亡，导致肿瘤细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD-1”基因进行克隆、表达及生物学活性鉴定，为制备抗体打基础。研究中所用引物α和β碱基序列见图1、几种常用限制酶名称及识别序列与酶切位点见图2：

α链：5'-T C A C T C G A G A C C A T G C A G A T C C C A C A G G C G C C C-3' β链：5'-C T C G A A T T C T C A G A G G G G C C A A G A G C A G T G-3' 图1

（1）首先提取细胞中的mRNA反转录生成____________________作为模板；设计含有不同的限制酶切点的α和β序列为引物，通过____________________技术扩增目的基因。

（2）选用图1中的两种名称分别为____________________的限制酶将“pIRES2-EGFP质粒”载体进行双切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。该表达载体的组成，除了目的基因、标记基因抗卡那霉素基因外，还必须具有____________________等。

（3）而后一定温度下，与经过处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有_____________培养基中，可筛选出已经完成转化的大肠杆菌，继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。

（4）将扩增后的“pIRES2-EGFP载体/PD-1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后，为确定PD-1基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有____________________。为判断其是否具有生物学活性和功能，则可裂解293T细胞，提取该物质看能否与____________________发生结合，从而阻断“PD-1与PDL-1信号通路”。研究中还会有一步骤，只将“pIRES2-EGFP载体”转入293T细胞，其目的是_________________________。

Answer 1

【答案】cDNA PCR Xho I EoR I 启动子、终止子、复制原点 卡那霉素 PD-1蛋白 PDL-1或答PD-1抗体 作为对照

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA采用分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质采用抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库（cDNA）。其中基因组文库包含某种生物所有的基因，而部分基因文库只包含某种生物的部分基因，可以mRNA为模板反转录形成cDNA；由于PCR技术利用的是DNA分子复制的原理，所以用该cDNA进行PCR技术扩增短时间内可以获得大量的目的基因。

（2）分析图1中碱基序列，α链上有“—CTCGAC—”识别序列，β链上有“—GAATTC—”碱基识别序列，与图2中XhoI限制酶和EoRI限制酶的识别序列相同。故选用XhoI限制酶和EoRI限制酶将“pIRES2-EGFP质粒”载体进行双切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。

（3）根据第（2）题可知，基因表达载体上的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此一定温度下，与经过 Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有卡那霉素的培养基，可筛选出已经完成转化的大肠杆菌。

（4）基因表达的产物是蛋白质，一段时间后，为确定PD-1基因是否表达，可以检测细胞膜表面是否具有PD-1基因表达的PD-1蛋白。为判断其是否具有生物学活性和功能，可采用抗原—抗体杂交技术，即从裂解293T细胞中，提取PD-1蛋白看能否与PDL-1发生结合，从而阻断“PD-1与PDL-1信号通路”。为了增加实验的可信度，还需要设置对照实验，只将“pIRES2-EGFP载体”转入293T细胞，因为不含PD-1基因，所以“PD-1与PDL-1信号通路”不会阻断。