【题目】穿梭载体是一类具有两种不同复制原点、能在两种不同的生物体(物种不同)中复制的载体,一般在原核生物和真核细胞中都能复制和表达,如Ti质粒和哺乳动物表达质粒pMT2。回答下列问题。

1)构建基因表达载体前,需先获取目的基因。PCR技术可用于目的基因的扩增,其原理是 ________。用PCR技术从基因文库中获取并扩增目的基因,需要加入人工合成的___做为引物;PCR反应体系中需加入的原料是____

2)若要构建一个穿梭质粒,使其能够在大肠杆菌中大量复制,且能在哺乳动物细胞中表达,质粒上除启动子、终止子、多个限制酶酶切位点和标记基因外,还需要有____的复制原点。

3)下图为某种哺乳动物穿梭质粒示意图,现欲使用该质粒表达人生长激素,但人生长激素基因所在的DNA片段上不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒,扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有____(填下图中的限制酶名称)的切割位点。

4)将该穿梭质粒、目的基因混合后形成的重组质粒与感受态的大肠杆菌细胞混合,完成转化过程,再从培养的大肠杆菌细胞中提取质粒,可获得大量该质粒。在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中____(填“一定”或“不一定”)含有目的基因,原因是____

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