【题目】番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化作用下转化。科学家利用基因工程设计的重组DNA(质粒三)能表达出双链RNA(发卡),番茄细胞可识别双链RNA并将该双链RNA和具有相同序列的单链RNA一起降解,从而阻止番茄红素的转化,提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。请回答下列问题:

1)该基因工程中,目的基因______基因,要想对该目的基因进行体外扩增,可从番茄组织中提取mRNA,通过逆转录获得______用于PCR扩增。PCR扩增目的基因,需要设计相应的引物,设计引物时要避免引物之间出现______

2PCR扩增时,DNA先在高温下解链,然后在温度缓慢下降的过程中,引物与解开的链结合,这个过程叫做退火。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。长度相同但______的引物需要设定更高的退火温度。

3)“质粒二”利用______开环。为了防止其自身环化,要去除开环的质粒两端的______个磷酸基团。

4)构建质粒三时,最好在目的基因AB两端分别加______识别序列,目的是______

5)对于培育成功的转基因番茄植株,发卡在细胞内可以阻止______过程,从而使番茄红素环化酶基因“沉默”。

【题目】人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓,是心梗和脑血栓的急救药,但是大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达改造后的基因,可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。下图表示通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和构建含t-PA改良基因重组质粒的过程示意图。图中重叠延伸PCR过程中,引物ab被用来扩增含有突变位点及其上游序列的DNA片段,引物cd被用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段。请回答:

1)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基,引物b中该部位的碱基是______,引物c该部位的碱基是______PCR中需要引物的原因是______

2)重叠延伸PCR中,PCR1PCR2分别进行,产物混合后再进行PCR3PCR1PCR2需要分别进行的原因是______

3)构建重组质粒时,选用的限制酶是______。重组质粒中的新霉素抗性基因的作用是______

4)在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株,需选择呈______色的菌落,进一步培养、检测和鉴定,以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生产改良t-PA蛋白的技术属于______工程。

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