【题目】图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoR V 酶切位点为,EcoR V 酶切出来的线性载体 P1 为__________未端。
(2)用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺 嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理,在两端各添加了一个碱基为___________ 的 脱氧核苷酸,形成 P2;P2 和目的基因片段在__________酶作用下,形成重组质 粒 P3。
(3)为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到 A、B、C 三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“﹣”代表不生长)。根据表 中结果判断,应选择的菌落是_____(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、___________________。
菌落类型 平板类型 | A | B | C |
无抗生素 | ﹢ | ﹢ | ﹢ |
氨苄青霉素 | ﹢ | ﹢ | ﹣ |
四环素 | ﹢ | ﹣ | ﹣ |
氨苄青霉素+四环素 | ﹢ | ﹣ | ﹣ |
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙 3 条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR 鉴定时应选择的一对引物是____________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一 菌落的质粒中扩增出了 400 bp 片段,原因是_______________。