【题目】细胞内具有多种miRNA对基因表达有重要的调节作用,研究人员利用基因编辑技术建立miRNA-301a(某种miRNA)基因敲除的小鼠模型,用于研究miRNA-301a的调节功能。请回答相关问题:

1)下图为miRNA形成和发挥作用的过程简图,据图可知miRNA基因通过___________形成前体miRNA,然后经过________过程形成miRNAmiRNA通过________调控翻译过程。

2)构建miRNA基因敲除的小鼠。其作用机制如下图所示。

注:gRNACas9蛋白结合后可以切割DNA

miRNA基因:根据miRNA基因序列设计并合成______________________,然后通过_________技术扩增得到miRNA基因。同理构建gRNA的模板DNA

构建基因表达载体:利用________________________酶构建如下图所示的基因表达载体。

通过体外转录获得miRNA-gRNA,再将miRNA-gRNACas9混合后采用显微注射技术注入小鼠__________________中。

3)经上述操作获得的8只小鼠称为F0代。

①经过限制酶Ⅰ剪切后电泳检测小鼠miRNA基因敲除情况如下图所示。

F0代小鼠检测其中5号为野生型,M为标准物)F0代中_____________号为基因敲除小鼠,经过基因测序后选择_____________与敲除碱基对数目最多的4号小鼠杂交,产生F1代小鼠。

②用限制酶Ⅱ剪切后电泳检测F1代小鼠如图1所示。

F1中选出4号和5号个体杂交产生F2代小鼠,然后用同种方法检测F2代小鼠结果如上图2所示,最终确定F2代中________号小鼠为miRNA基因敲除纯合子小鼠。

 0  167083  167091  167097  167101  167107  167109  167113  167119  167121  167127  167133  167137  167139  167143  167149  167151  167157  167161  167163  167167  167169  167173  167175  167177  167178  167179  167181  167182  167183  167185  167187  167191  167193  167197  167199  167203  167209  167211  167217  167221  167223  167227  167233  167239  167241  167247  167251  167253  167259  167263  167269  167277  170175 

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