5.基因工程
pUC18是基因工程中常用的质粒运载体,其结构如图1(其中HindⅢ、PstⅠ、EcoRⅠ等限制酶的识别位点之间的碱基对数忽略不计,lacZ是显色基因).

现将扩增的含目的基因的外源DNA片段与pUC18质粒都用PstI进行酶切,然后用DNA连接酶进行连接,构建重组质粒.为筛选非重组子和重组子,分别用不同的限制酶进行酶切.经琼脂糖凝胶电泳结果如图1(1kb=1000对碱基).请据图分析回答:
(1)与pUC18质粒重组的目的基因大小为4kb.
(2)用kpnⅠ酶切pUC18质粒,产生了1条2.7kb的带;用kpnⅠ酶切重组质粒,产生了2条带,但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb两组数据(图2).下列说法中合理的是AC(多选)
A.重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点,且其中一个位于目的基因的区段
B.重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点,都位于目的基因的区段
C.产生两种酶切的结果,推测是目的基因与开环的pUC18拼接时有两种可能的插入方向
D.产生两种酶切的结果,推测是另有一种限制酶的酶切位点的碱基序列与kpnⅠ相同
(3)请在目的基因上标注kpnⅠ酶切位点(需注明目的基因的碱基对数量及kpnⅠ酶切位点两侧的碱基对数量)

(4)大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因,lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶,当培养基中含有IPTG和X-gal时,X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色,大肠杆菌将形成蓝色菌落.反之,则形成白色菌落.选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外,还应加X-gal、IPTG、氨苄青霉素入物质.成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白色颜色的菌落,原因是lacZ基因被插入目的基因而失活.
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