13.bar基因(抗除草剂基因)对除草剂PPT有抗性,来自吸水链霉菌.下列资料是抗PPT转基因棉的培育过程.
资料1:根据bar基因两端已知的碱基序列,设计合成了如下引物:
上游引物:5′-CGGAATT…C-3′
下游引物:5′-TACAAGCTT…G-3′
PCR扩增程序为:预变性后,94℃、30S;65℃、30S;72℃、1min,共35个循环.
资料2:用EcoRI/HindⅢ双酶切PCR产物和质粒pET30后,用T4-DNA连接酶连接,构建bar基因表达载体(pET30-bar),EcoRI识别切割G↑AATTC,HindⅢ识别切割A↑AGCTT.
资料3:将pET30-bar导入处于感受态的根癌农杆菌中,用含有卡那霉素的YEB固体培养基筛选出转化的根癌农杆菌,将其菌液加入棉花愈伤组织培养基中,20天后,再移入分化培养基诱导生芽、生根,形成试管苗后移栽.
情分析回答:
Ⅰ、根据资料1分析:
(1)目的基因的获取方法为PCR扩增,在PCR扩增时,除DNA模板外,还需要Taq酶和原料,Taq酶的特点是耐高温.
Ⅱ、根据资料2回答:
(2)用EcoRⅠ/HindⅢ对质粒和PCR产物进行双酶切得原因有ABCD(多选).
A.防止质粒自身环化         B.防止bar基因自身环化
C.利于bar基因的单向连接    D.抑制切割后的分子串连形成寡素物
Ⅲ、根据材料3分析:
(3)用Ca2+(CaCI2)处理,可使根癌农杆菌进入感受态,为筛选出含bar基因的棉花愈伤组织,在愈伤组织培养基中除加入卡那霉素外,还应加入适宜浓度的除草剂PPT.在分化培养时,通过调节生长素和细胞分裂素的比例,完成对根、芽的分化诱导.
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