Question

12．病毒介导基因转移是现在基因治疗研究的最新方向，美、法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移．其具体思路如图所示：

回答下列问题：
（1）如果要在短时间内获得较多的目的基因，通常采用PCR技术，在操作步骤中包括两次升温和一次降温，其中降温的目的是使引物和模板链结合．
（2）构建基因表达载体时需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶．
（3）作为接受转移基因的体细胞应具有的特点是具有增殖优势（生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；必须比较坚固，足以耐受处理）（写出一点即可）．在进行细胞培养时，当细胞贴满瓶壁时需用胰蛋白酶处理，使之分散成单个细胞，培养液中还需通人无菌气体，其中通入CO₂的目的主要是维持培养液的PH．
（4）如果检测发现目的基因被成功导入了受体细胞，但却没有检测到目的基因相对应的蛋白质，应考虑位于目的基因首端的启动子和末端的终止子是否设计好，并从这方面进一步改善．

Answer 1

分析 1、PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成．
（3）条件：模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等．
2、动物细胞培养的条件：
（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物．
（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质．
（3）温度和PH．
（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO₂（维持培养液的PH）．

解答 解：（1）如果要在短时间内获得较多的目的基因，通常采用PCR技术，第一次升温是使双链解开，即高温解链；降温的目的是使引物和模板链结合，即低温复性；第二次升温是使DNA复制开始进行．．
（2）构建基因表达载体时需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶．
（3）作为接受转移基因的体细胞应具有的特点是 具有增殖优势；生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；必须比较坚固，足以耐受处理等．在进行细胞培养时，当细胞贴满瓶壁时需用胰蛋白酶处理，使之分散成单个细胞，培养液中还需通人无菌气体，其中通入CO₂的目的主要是维持培养液的PH．
（4）基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，启动子位于目的基因的首端，启动基因的转录，终止子位于目的基因的末端，终止转录过程．
故答案为：
（1）PCR    使引物和模板链结合
（2）限制酶和DNA连接酶
（3）具有增殖优势（生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；必须比较坚固，足以耐受处理）   胰蛋白    维持培养液的PH
（4）启动子    终止子

点评 本题考查了基因工程和细胞工程的有关知识，要求考生能够掌握基因工程的工具、操作步骤，识记PCR技术中三步骤的目的，识记动物细胞培养的过程，识记基因表达载体的组成等．