Question

18．在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值．如图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：
（1）获取目的基因的主要途径包括从获取直接分离获得和人工合成方法．
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建．①过程需要的酶有限制酶、DNA连接酶．
（3）重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和标记基因，这样才能构成一个完整的基因表达载体．
（4）目的基因进入受体细胞C₂，并将其插入到受体细胞C₂中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣，该过程叫转化作用．经②过程获得的转基因莴苣中的目的基因是否表达，在分子水平上可用抗原-抗体杂交法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因莴苣培育成功．
（5）科学家在培养转基因植物时，常用农杆菌中的质粒做运载体．借助于该质粒上的片段将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上．该方法叫农杆菌转化法．
（6）质粒是基因工程最常用的运载体，它具备运载体的条件：
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；②具有多个酶切位点，以便与外源基因连接；③具有某些标记基因，便于进行筛选．

Answer 1

分析 基因工程的操作步骤为
第一步：目的基因的获取
（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因．
（2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法．
（3）PCR技术扩增目的基因
第二步：基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用．
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等．
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术．此方法的受体细胞多是受精卵．
将目的基因导入微生物细胞：Ca²⁺转化法．
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达．
第四步：目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术．
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交．
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交．
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定．如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状．

解答 解：（1）目的基因的获取可采取直接分离获得也可采用人工合成方法，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法．              
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；提取目的基因需限制酶，将目的基因与运载体结合需DNA连接酶，故①过程需要的酶有限制酶和DNA连接酶．           
（3）基因表达载体包含：目的基因+启动子+终止子+标记基因．          
（4）农杆菌转化法利用的是农杆菌的转化作用，将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，进而使目的基因能够稳定遗传和表达．检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交．最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交．
（5）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术．
（6）科学家在培养转基因植物时，常用原核生物中的质粒做运载体．质粒是基因工程最常用的运载体，它具备运载体条件：①能够在宿主细胞中自我复制；②至少一个酶切位点，便于外源基因连接；③具有某些标记基因，便于目的基因的鉴定与筛选．
故选答案为：
（1）直接分离获得  人工合成方法
（2）基因表达载体的构建   限制酶 DNA连接酶
（3）标记基因
（4）染色体的DNA  转化作用  抗原-抗体杂交
（5）农杆菌转化法
（6）复制  酶切位点   标记基因

点评 本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握基因工程的操作工具、操作步骤以及相应的生理基础等；识记质粒能够作为运载体的条件等，难度适中，属于考纲中识记、理解层次的考查．