Question

20．2016年9月研究人员发现，从锥形蜗牛体内提取出的毒液有望帮助人类开发出超级速效的胰岛素．回答下列问题：
（1）科研人员尝试利用基因工程制造锥形蜗牛毒蛋白．在基因工程中，质粒载体作为某因工程的工具，应具有的基本条件是能够自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点（答出两点即可）；而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还须具有目的基因、启动子和终止子．基因工程中既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端的是T₄DNA连接酶．
（2）为了获得目的基因可以通过提取分析锥形蜗牛毒蛋白中的氨基酸序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，在用PCR技术大量扩增目的基因．在用PCR技术扩增DNA时，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次．
（3）将人工合成的目的基因导入大肠杆菌体内，一般需要先用Ca²⁺处理大肠杆菌使之成为感受态细胞．经过目的基因的检测和表达，获得的锥形蜗牛毒蛋白活性未能达到期待的“速效胰岛素”的生物活性，导致这种差异的原因可能是大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经内质网和高尔基体的加工．

Answer 1

分析 1、作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来．
2、两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T₄DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键．
②区别：E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T₄DNA连接酶来源于T₄噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低．
3、将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca²⁺处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程．

解答 解：（1）在基因工程中，质粒载体作为某因工程的工具，应具有的基本条件是能够自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点；基因工程中，T₄DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端．
（2）为了获得目的基因可以通过提取分析锥形蜗牛毒蛋白中的氨基酸序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，在用PCR技术大量扩增目的基因．在用PCR技术扩增DNA时，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次．
（3）将目的基因导入微生物细胞中一般采用钙离子转化法，即用Ca²⁺处理大肠杆菌使之成为感受态细胞．由于大肠杆菌属于原核生物，原核细胞中没有内质网和高尔基体，因此基因表达获得的蛋白质未经内质网和高尔基体的加工不具有期待的生物学活性．
故答案为：
（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点       T₄DNA连接
（2）氨基酸   引物  延伸
（3）Ca²⁺大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经内质网和高尔基体的加工

点评 本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够识记作为运载体必须具备的条件，识记目的基因导入受体细胞的方法，能够根据原核细胞的结构特点解释“速效胰岛素”不具有期待的生物学活性的原因．