Question

17．科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高．如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp^r为抗氨苄青霉素基因），其中PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ为限制酶切割位点，①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤．请据图回答有关问题．

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或多种限制酶进行切割，在此实例中，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接（或目的基因自连、质粒自连），应该选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ，分别对含鱼的抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．
（2）农杆菌作为中间受体，重组质粒如何进入农杆菌：先用Ca²⁺处理细胞，使细胞成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进受体细胞吸收DNA分子，完成转化过程．
（3）在组织培养过程中，除添加必要的营养物质，还需要向培养基中添加植物激素（生长素和细胞分裂素），同时除提供适宜的温度、光照和氧气等环境条件外，成功的另一关键是无菌操作．
（4）将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞后，通常采用抗冻接种实验，在个体水平上检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．

Answer 1

分析 分析图解：鱼的抗冻蛋白基因上具有三种限制酶切割位点，PstⅠ酶的切割位点存在于目的基因的两侧，SmaⅠ酶的切割位点存在于目的基因的左侧，而AluⅠ酶的切割位点存在于目的基因的中央，因此不宜选用AluⅠ酶．质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，在选择限制酶时一般选择同种限制酶，以便形成相同的黏性末端．图中①～④分别表示：基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、脱分化、再分化．

解答 解：（1）在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接（或目的基因自连、质粒自连），故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端．由于AluⅠ酶的切割位点存在于目的基因的中央，因此不宜选用AluⅠ酶，则应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．
（2）将目的基因导入微生物细胞需要采用感受态细胞法，即先用Ca²⁺处理细胞，使细胞成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进受体细胞吸收DNA分子，完成转化过程．
（3）在组织培养过程中，除添加必要的营养物质，还需要向培养基中添加植物激素（生长素和细胞分裂素），同时除提供适宜的温度、光照和氧气等环境条件外，成功的另一关键是无菌操作．
（4）将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞后，通常采用抗冻接种实验，在个体水平上检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．
故答案为：
（1）目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接（或目的基因自连、质粒自连）    PstⅠ、SmaⅠ含鱼的抗冻蛋白基因的DNA、质粒
（2）重组表达载体DNA分子        温度
（3）植物激素（生长素和细胞分裂素）    无菌操作
（4）抗冻接种

点评 本题具有一定的难度，属于考纲中理解层次的要求，考查了基因工程的工具酶、目的基因导入受体细胞以及利用植物组织培养技术培养转基因植株的相关知识，解答的难点是能够根据目的基因和质粒上的切割位点选择合适的限制酶．