Question

【题目】Ⅰ黑腐皮壳菌是一种能引发苹果植株腐烂病的真菌。现欲对该菌进行分离培养和应用的研究，下表是分离培养时所用的培养基配方。请回答：

物质	马铃薯	葡萄糖	自来水	氯霉素	琼脂
含量	200g	20g	1000mL	0．3g	20 g

（1）上述配方中，可为真菌生长繁殖提供碳源的是____；氯霉素的作用是____。

（2）培养基制备时应_____（填“先灭菌后倒平板”或“先倒平板再灭菌”）。待冷却凝固后，应将平板____，以防止冷凝水污染培养基。

（3）为检测某苹果植株黑腐皮壳菌感染程度，需对该植株患病组织进行病菌计数，故应将提取的菌液采用____法进行接种。

（4）科研人员将该真菌分别置于液体培养基和固体培养基中培养，获得图所示的生长速率曲线。图中____(选填“a”或“b”)曲线表示该菌在液体培养基中的生长曲线。17h后，该菌生长速率偏低的原因可能是____、____。

ⅡSARS是由冠状病毒SARS-CoV引起的一种急性呼吸道传染病，具有发病急、传播快、病死率高的特征，其病原体结构如上图所示。人体感染SARS病毒后，不会立即发病，一般是在2-7天的潜伏期后才出现肺炎的症状，使诊断和预防更加困难。请回答：

（1）检测血浆中的SARS病毒抗体含量不能及时诊断人体是否感染病毒，原因是____。为及时确诊，科学家研制了基因检测试剂盒，其机理为：分离待测个体细胞的总RNA，在____酶的作用下得到相应的DNA，再利用____技术扩增将样本中微量的病毒信息放大，最后以荧光的方式读取信号。

（2）研究发现，SARS病毒的S蛋白是SARS重组疫苗研究的重要候选抗原。现已知SARS的S蛋白基因序列，经____方法得到4条基因片段：f1、f2、f3和f4，再通过____酶处理可得到控制S蛋白合成的全长DNA序列f1+f2+f3+f4，即为目的基因。再将之与载体连接形成____、导入受体细胞以及筛选、检测等过程即可完成重组疫苗的制备。

（3）科研人员利用重组的SARS-CoV的N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白作抗原免疫小鼠，制备抗SARS-CoV的单克隆抗体。取免疫小鼠的____细胞与骨髓瘤细胞，诱导融合后转入HAT培养基中进行筛选。对所得的细胞再利用融合蛋白进行____，选择阳性细胞进行克隆化培养，分离提纯相应抗体。

Answer 1

【答案】马铃薯、葡萄糖 抑制细菌等杂菌的生长 先灭菌后倒平板 倒置 稀释涂布平板/涂布分离 a 培养基中的营养成分不足有害有毒的物质积累 种群数量大 启动免疫应答需要时间比较长/感染病毒后人体产生抗体所需时间长 逆转录 PCR 化学合成/人工合成 限制性核酸内切酶和DNA连接 重组DNA/重组质粒 脾细胞/B淋巴细胞/浆细胞 抗体检测/抗原抗体杂交

【解析】

1、培养基按物理性质分：

名称	特征	功能
固体培养基	外观显固体状态的培养基	主要用于微生物的分离、鉴定
液体培养基	呈液体状态的培养基	主要用于工业生产

2、微生物接种常用的两种方法：

①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。

②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。

3、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。

Ⅰ（1）培养基的基本成分包括碳源、氮源、无机盐和水，表中马铃薯和葡萄糖可为微生物生长提供碳源；氯霉素是一种抗生素，其作用是抑制细菌等杂菌的生长。

（2）培养基的制备步骤包括计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板，因此是先灭菌后倒平板。平板冷却凝固后将平板倒置，目的是防止冷凝水污染培养基。

（3）接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中只有稀释涂布平板法能对微生物进行计数，因此对该植株患病组织进行病菌计数研究时，应将提取的菌液采用稀释涂布平板法进行接种。

（4）液体培养基能扩大培养微生物，因此图中a曲线表示该菌在液体培养基中的生长曲线。17h后，该菌生长速率偏低的原因可能是：培养基中的营养成分不足、有害有毒的物质积累、种群数量大，种内斗争激烈等。

Ⅱ（1）感染病毒后人体产生抗体需要一定的时间，因此检测血浆中抗体含量不能及时诊断人体是否感染病毒。对于该病毒的检测手段主要为利用荧光PCR试剂盒对其核酸进行检测。其原理是，通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR，即先通过逆转录获得cDNA，然后以其为模板进行PCR），通过扩增反应将样本中微量的病毒信息加以放大，最后以荧光的方式读取信号。

（2）已知基因序列，可以通过人工合成的方法获得基因片段，将所获得的片段通过限制性核酸内切酶和DNA连接酶可获得全长的目的基因，目的基因与质粒连接形成重组质粒后再导入受体细胞中。

（3）制备单克隆抗体过程中，取已经免疫的小鼠的B淋巴细胞与骨髓细胞进行融合后进行两次筛选，对所得的细胞再利用融合蛋白进行抗体检测，最终选择阳性细胞进行克隆化培养。