Question

【题目】某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称甲),并将其插入质粒P0。构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题:

(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是__________。图中的启动子可作为_______________的结合位点，催动转录的进行。

(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了_________,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成表达。基因工程的核心步骤是______________________。

(3)通过___________的方法将目的基因导入牛的________中，再经过早期胚胎培养，胚胎移植等过程，获得含有甲的转基因牛。

(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的______________ (填"mRNA""总RNA"或"核DNA")作为PCR模板。

Answer 1

【答案】E1和E4 RNA聚合酶 绿色的荧光 基因表达载体的构建 显微注射 受精卵 核DNA

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

(1) 使用E1、E4这两种酶进行酶切可以保证目的基因甲的完整性， 图中的启动子可作为RNA聚合酶的结合位点，催化转录的进行。

(2) 在该细胞中观察到了绿色的荧光，说明基因已表达，即L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。

(3)通过显微注射的方法将目的基因导入牛的受精卵中，再进行体外培养、胚胎移植等相关操作获得转基因牛。

(4) 为检测L1-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。PCR技术是体外DNA复制技术，故在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板 。