Question

4．科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达．但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选．已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，据图回答：

（1）过程①表示的是采取反转录（人工合成）的方法来获取目的基因，为了扩增目的基因，常常采用PCR方法达到目的，其前提是要有一段已知的有一段已知的核苷酸序列．
（2）根据图示分析，在构建基因表达载体过程中，应用限制酶Ⅰ切割质粒以便于筛选，用限制酶Ⅱ切割目的基因．用限制酶切割目的基因和运载体后形成的黏性末端通过碱基互补配对原则进行连接．
（3）将重组质粒导入细菌B时采用的方法是用用CaCl₂处理细菌细胞获得感受态细胞处理，人体的生长激素基因能在细菌体内成功表达是因为共用一套密码子，写出目的基因在细菌B中表达的过程．
（4）将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长，说明大肠杆菌B已导入了普通质粒或重组质粒，反之则没有导入．接着采用分子杂交技术鉴定目的基因是否成功转录，采用抗原抗体杂交技术鉴定目的基因是否成功表达．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）过程①是以mRNA为模板形成基因的过程，属于反转录，此过程需要逆转录酶的参与．为了扩增目的基因，常采用PCR技术扩增，其前提是要有一段已知的有一段已知的核苷酸序列，以便合成引物．
（2）在构建基因表达载体时，需用限制酶对目的基因和质粒进行切割以形成相同的黏性末端．质粒如果用限制酶Ⅱ来切割的话，将会在质粒在出现两个切口且抗生素抗性基因全被破坏，故质粒只能用限制酶Ⅰ切割（破坏四环素抗性而保留氨苄青霉素抗性，即将来形成的重组质粒能在含氨苄青霉素的培养基中生存，而在含四环素的培养基中不能生存）；目的基因两端都出现黏性末端时才能和质粒发生重组，故目的基因只有用限制酶Ⅱ切割时，才会在两端都出现黏性末端．黏性末端其实是被限制酶切开的DNA两条单链的切口，这个切口上带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好通过碱基互补配对进行连接．
（3）将重组质粒导入细菌B时需要用CaCl₂处理细菌细胞，以获得感受态细胞．所有的生物都共用一套密码子，所以人体的生长激素基因能在细菌体内成功表达，过程是生长激素基因→mRNA→生长激素．
（4）因本题上有2个标记基因，但抗四环素基因被插入的目的基因破坏掉，因此剩下的是抗氨苄青霉素抗性基因，如果在含氨苄青霉素的培养基上能生长，说明已经导入了重组质粒或普通质粒A，因为普通质粒和重组质粒都含有抗氨苄青霉素的基因．目的基因的检测和鉴定过程中，一般采用分子杂交技术鉴定目的基因是否成功转录，采用抗原抗体杂交技术鉴定目的基因是否成功表达．
故答案为：
（1）反转录（人工合成）   PCR   有一段已知的核苷酸序列
（2）ⅠⅡ碱基互补配对
（3）用CaCl₂处理细菌细胞获得感受态细胞      共用一套密码子

（4）普通质粒或重组质粒        分子杂交技术      抗原抗体杂交技术

点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，能结合所学的知识准确答题．