题目内容
【题目】科研人员用基因工程技术构建拟南芥突变体库，并研究光信号（远红光）控制拟南芥种子萌发时下胚轴生长的分子机制。
（1）拟南芥突变体库的构建过程如下。
①将插入了氨苄青霉素抗性基因的T-DNA与农杆菌在液体培养基中振荡培养，获得转化液。将转化液稀释后对野生型拟南芥进行转化，继续培养拟南芥植株并收获其种子，再将种子放入含有____________的培养基中培养筛选出能正常萌发的种子，命名为F1代种子, F1代种子因插入了含有氨苄青霉素抗性基因的T-DNA导致DNA分子发生了_____________这一分子结构上的变化。
②下面是利用F1种子构建纯合突变体库的流程图。
将每株F1植株所结种子（F2代种子）单株存放，用①中的方法筛选F2代种子，表现为正常萌发和不能正常萌发比例约为____________时，F1植株为单拷贝插入（只有一个位点插入T-DNA）的杂合转基因植株用同样的方法筛选出单株F2。植株所结种子（F3代种子），若都能正常萌发，则F3植株为纯合转基因植株；F3自交得到F4代种子即为纯合突变体库。
（2）将上述突变体库中的种子置于远红光条件下培养，挑选出拟南芥种子萌发时下胚轴明显变长的甲、乙、丙三个突变体植株。
①将甲、乙、丙分别与野生型杂交，其后代种子在远红光下培养，萌发时均表现为下胚轴长度与野生型无明显差异，说明3株突变均为___________突变。
②将甲和乙杂交得到种子在远红光下培养，萌发时下胚轴长度与甲和乙两株相比均无明显差异。请在图画出甲、乙突变基因与其以及对应的染色体的关系______（甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示）。
③将甲和丙杂交得到种子在远红光下培养，萌发时表现为________则可推测甲和丙的突变基因为非等位基因。
（3）科研人员还获得了甲和丙的双突变体，并在远红光条件下培养，测定其种子萌发时下胚轴的长度，结果如下图。
有人提出了下面两种种子萌发时基因调控下胚轴生长的示意图（A、a表示甲的相关基因；D、d表示丙的相关基因）。
为验证上述两种推测是否正确，进行了下列实验。
①已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究发现远红光下，D蛋白进核后才能调控种子萌发时下胚轴的生长。将绿色荧光蛋白基因与D基因启动子连接，分别转入野生型和突变体甲，将其幼苗在黑暗处理4天，再在远红光处理30分钟，发现两种转基因植株细胞核中均出现绿色荧光且强度无明显差异。该实验结果说明_____________________________
②分别提取黑暗条件和远红光条件下野生型和突变型甲的细胞质和细胞核蛋白，得到D蛋白的电泳结果如下图。
上述结果表明，在远红光条件下，磷酸化D蛋白只在___________拟南芥植株的__________中大量积累，由此推测______________（图1、图2）更为合理。
【答案】氨苄青霉素 碱基对的增加 3：1 隐性 
下胚轴长度与野生型无明显差别 A蛋白不参与远红光条件下D蛋白向核内的转移 野生型 细胞核 图1
【解析】
1、Ti质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被称为T-DNA。根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将相关基因置入T-DNA区段中，可通过农杆菌侵染细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法；
2、含有氨苄青霉素抗性基因的拟南芥植株产生的种子，在含有氨苄青霉素的培养基中能正常萌发。光信号（远红光）对拟南芥种子萌发时下胚轴的长度有影响。
（1）①将氨苄青霉素抗性基因插入Ti质粒的T-DNA中，构建基因表达载体，即重组质粒，并导入农杆菌中。将转化液稀释后对野生型拟南芥进行转化，继续培养拟南芥植株并收获其种子，再将种子放入含有氨苄青霉素的培养基中培养筛选出能正常萌发的种子，命名为F1代种子, F1代种子因插入了含有氨苄青霉素抗性基因的T-DNA导致基因突变，即DNA分子发生了碱基对的增加这一分子结构上的变化。
②F1植株为单拷贝插入（只有一个位点插入T-DNA）的杂合转基因植株用同样的方法筛选出单株F2。植株所结种子（F3代种子），若都能正常萌发，则F3植株为纯合转基因植株；F3自交得到F4代种子即为纯合突变体库。由于F1植株为杂合子,即突变型拟南芥（假设基因型为Aa）自交后代中，氨苄青霉素抗性（A_）：氨苄青霉素敏感（aa）=3:1，将每株F1植株所结种子（F2代种子）单株存放，用①中的方法筛选F2代种子，含有氨苄青霉素抗性基因的种子能够正常萌发，因此，表现为正常萌发和不能正常萌发比例约为3:1。
（2）①基因突变分为显性突变和隐性突变。将甲、乙、丙分别与野生型杂交，其后代种子在远红光下培养，萌发时均表现为下胚轴长度与野生型无明显差异，说明野生型为显性性状， 3种突变均为隐性突变。
②甲和乙发生的均为隐性突变，将甲和乙杂交得到种子在远红光下培养，萌发时下胚轴长度与甲和乙两株相比均无明显差异，说明长度与甲、乙比，没有区别，因此，是同一位点的基因突变。甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示，则甲突变个体是A突变为a，乙突变个体是B突变为b，甲、乙突变基因与其以及对应的染色体的关系如图所示：
③将甲和丙杂交得到种子在远红光下培养，萌发时表现为下胚轴长度与野生型无明显差异，说明甲丙突变的不是同一位点，则可推测甲和丙的突变基因为非等位基因。
（3）①经过前面的分析，突变体均为隐性突变，故野生型基因型为AADD，甲突变体的基因型为aaDD，丙突变体的基因型为AAdd，双突变体的基因型为aadd。已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究发现远红光下，D蛋白进核后才能调控种子萌发时下胚轴的生长。将绿色荧光蛋白基因与D基因启动子连接，分别转入野生型和突变体甲，将其幼苗在黑暗处理4天，再在远红光处理30分钟，发现两种转基因植株细胞核中均出现绿色荧光且强度无明显差异。野生型有A基因，即有A蛋白，甲无A基因，即无A蛋白，故自变量为A蛋白的有无，而两者细胞核中均有绿色荧光，即两者均有D蛋白向细胞核转移，因此，该实验结果说明A蛋白不参与远红光条件下D蛋白向核内的转移。
②D蛋白的电泳结果图表明，1代表磷酸化D蛋白，即为功能异常的D蛋白，2代表非磷酸化D蛋白，即为功能正常的D蛋白，在远红光条件下，野生型的细胞核中既有磷酸化D蛋白，又有非磷酸化D蛋白，而甲突变体aaDD的细胞核中只有正常功能的D蛋白，说明甲突变体aaDD抑制了D基因的磷酸化，因此，磷酸化D蛋白只在野生型拟南芥植株的细胞核中大量积累，由此推测图1更为合理。
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