Question

6．研究人员利用小鼠（2N=40）的单倍体ES细胞（只有一个染色体组），成功培育出转基因小鼠，其主要技术流程如图所示：

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四种限制酶，箭头指向的位置为限制酶的切割位置；Amp′是氨苄青霉素抗性基因，Neo′是G418抗性基因．
（1）重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞，结合如图推测，过程①选用的2种限制酶是Ⅰ和Ⅱ（选填图中的编号），图中③处的培养液应添加G418（填“氨苄青霉素”或“G418”）．
（2）若图中过程①选用的2种限制酶识别序列和切割位置分别是和，则经这两种限制酶切割后所产生的黏性末端是，此时，图中过程②应选用T₄DNA连接酶（填“E•coliDNA连接酶”或“T₄DNA连接酶”）．
（3）据图分析，细胞乙内除线粒体DNA外，还有40个DNA分子；细胞乙发育成桑椹胚的过程中细胞分裂方式是有丝分裂，将细胞乙培养成桑椹胚的技术称为早期胚胎培养技术．

Answer 1

分析 1、分析图解：图中过程①表示利用同种限制酶切割目的基因和质粒，过程②表示利用DNA连接酶构建重组质粒，过程③表示将重组质粒导入小鼠单倍体ES细胞后对该细胞进行培养、筛选，经过细胞核移植后对获得细胞核的卵母细胞进行早期胚胎培养．
2、两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T₄DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键．
②区别：E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T₄DNA连接酶来源于T₄噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低．

解答 解：（1）重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞．根据题意可知，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞，因此应选择Neo′作为标记基因，即质粒上Neo′不能用限制酶切割，则过程①应选用Ⅰ和Ⅱ2种限制酶，图中③处的培养液应添加G418．
（2）若图中过程①选用的2种限制酶识别序列和切割位置分别是和，前者被限制酶切割形成的是黏性末端，后者被限制酶切割形成的是平末端，即经这两种限制酶切割后所产生的黏性末端是，此时，图中过程②应选用T₄DNA连接酶．
（3）根据题意可知，小鼠的染色体为2N=40，因此单倍体ES细胞的细胞核中染色体有20条，完成减数分裂后的卵细胞中也有20条染色体，即细胞乙内除线粒体DNA外，细胞核中有40个DNA分子；细胞乙发育成桑椹胚的过程中细胞分裂方式是有丝分裂，将细胞乙培养成桑椹胚的技术称为早期胚胎培养技术．
故答案为：
（1）标记基因Ⅰ和ⅡG418
（2）

T₄DNA连接酶
（3）40     有丝分裂     早期胚胎培养

点评 本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够图示和题干信息确定合适的限制酶，并根据限制酶识别序列和切割位点确定DNA连接酶的种类，再结合所学知识准确答题．