Question

【题目】融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如下图1所示。下图2是中间载体1和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于载体外侧），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题。

（1）图1第一阶段中PCR至少进行____________次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。

（2）若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计__________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__________种。

（3）图2中需使用_________________（填限制酶）和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。

（4）叶绿体定点整合表达载体中____________（填基因）能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是_______。

Answer 1

【答案】 2 互补配对 8 6 Spe I、Sal I 复制原点 叶绿体同源重组基因1和叶绿体同源重组基因2 能实现定点整合到叶绿体中，且不易随花粉扩散带来安全问题

【解析】试题分析：熟记并理解基因工程的基本操作程序，特别是利用PCR技术扩增目的基因的过程等相关的基础知识，形成清晰的知识网络。在此基础上结合题意并从题图中提取信息进行相关问题的作答。

(1)分析图1可知：在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增（循环），得到的含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增（循环），才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。

(2)图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。

(3) 图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe I和Sal I的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe I和Sal I的识别位点，因此图2中需使用Spe I、Sal I和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。

(4)综上分析：在叶绿体定点整合表达载体中，叶绿体同源重组基因1和叶绿体同源重组基因2能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是：能实现定点整合到叶绿体中，且不易随花粉扩散带来安全问题。