题目内容
【题目】蛋白酶广泛用于化工、食品、医药工业，因此采用生物工程技术规模化生产重组蛋白酶具有重要经济价值。已知某蛋白酶编码基因的两端分别为KpnI和ClaI限制酶酶切位点，现将之插入在质粒pCLY9合适位点处（图1），并导入大肠杆菌L44株中高效表达。L44株因缺乏gatB基因不能以NH4Cl为原料合成重要的细胞大分子，而且对氯霉素（Cm）敏感。
（1）若用ClaI和KpnI 酶切pCLY9可获得0.8和4.8kb两种片段；而用KpnI和SmaI酶切重组质粒可获得2.5和3.1kb两种片段，那么目的基因的大小是_____kb。
（2）为了获得含重组质粒的细胞，应采用两步法筛选。其中用于第一步筛选的固体培养基的配方是_____。
A．蛋白胨、酵母粉、牛肉膏
B．葡萄糖、NH4Cl、生长因子
C．牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、氯霉素
D．葡萄糖、蛋白胨、生长因子、氯霉素
（3）上述含重组质粒的大肠杆菌经大规模培养后，破碎菌体获得细胞裂解液。图2是裂解液中多种酶活性随温度变化的趋势，由此可以判断该重组蛋白酶在实际应用中的最佳反应温度范围应从_____℃到_____℃。
（4）一般而言，固定化处理能不同程度地提高酶的热稳定性。若将上述大肠杆菌细胞裂解液不经分离纯化直接固定化，能否充分体现这种蛋白酶的使用优势？_____，为什么？_____。
（5）本大题中所涉及的生物工程包括_____。
A．基因工程 B．细胞工程 C．发酵工程 D．酶工程
【答案】0.8 A 55 70 不能 杂酶也会因固定化而变得热稳定，这样不便与高温蛋白酶的活性相隔离 ACD
【解析】
1、获得目的基因的方法：①从基因文库中获取 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成（化学合成）．原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
2、“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
3、基因表达载体的构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因，标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（1）由题意知：用ClaI和KpnI 酶切pCLY9可获得0.8和4.8kb两种片段，而用KpnI和SmaI酶切重组质粒可获得2.5和3.1kb两种片段，说明质粒的长度为5.6kb，目的基因的大小是0.8kb。
（2）采用两步法筛选获得含重组质粒的细胞，第一步筛选的固体培养基含有蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，故选A。
（3）由图2可知：在30℃到55℃，虽然重组蛋白酶活性高，但其余杂酶的活性也高，故该重组蛋白酶在实际应用中的最佳反应温度范围应从55℃到70℃。
（4）由于杂酶也会因固定化而变得热稳定，这样不便与高温蛋白酶的活性相隔离，故若大肠杆菌细胞裂解液不经分离纯化直接固定化，不能充分体现该蛋白酶的使用优势。
（5）本题涉及基因工程、发酵工程及酶工程的相关知识，故选ACD。
