题目内容
(6分)请回答PCR方面的有关问题:
(1)引物是扩增过程中必须加入的物质,从化学本质上说,引物是一小段_______________。
(2)引物是子链合成延伸的基础,如下图。
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从理论上推测。第四轮循环产物中两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段所占DNA总数的比例为 。
(3)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)不合理(如下图),请说明理由 。
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(4)在DNA聚合酶的作用下,两条子链的延伸方向都是 。
(5)假如引物都用3H标记,从理论上计算,所得DNA分子中含有3H标记的占 。
(6)与体内DNA复制相比,PCR反应体系除引物外,还需加入哪种特别的物质? 。
(6分)(1)DNA或RNA (2)50%
(3)引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(4)从子链的5′端向3′端延伸(5)100%(6)Taq 酶
【解析】基因扩增中引物通常是一小段DNA或RNA片段,第二轮中含引物II(或考题中的引物A)比例为3/4,第三轮中占7/8,即所有DNA片段中,只有一个片段不含引物II,故推测在第四轮中,含引物II(或引物A)的比例为15/16。与两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段所占DNA总数的比例为50%,由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点,因此第一轮循环后,得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长,通过自行绘图可推知,第二轮中亦不会出现等长的引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
1、引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
5、引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
PCR技术扩增DNA需加入特定的Taq酶。复制过程子链的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸