Question

8．转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入线粒体和叶绿体，增强相关细胞器的功能．为增加油菜籽的含油量，研究人员分别从陆地棉和拟南芥中克隆了酶N基因和转运肽基因，并连接形成融合基因，将其导入油菜后，获得了高油转基因油菜．
（1）在已知酶N基因、转运肽基因的上游及下游碱基序列的情况下，可人工设计合成引物用于和模板单链结合，作为多聚核苷酸链延伸的起点．在PCR扩增中所需的关键酶是Taq酶．
（2）酶N基因和转运肽基因的限制酶切点如图1，形成融合基因前，应用限制酶SacI处理两个基因，再用DNA连接酶连接成融合基因．

（3）Ti质粒存在于农杆菌中，构建目的基因表达载体时，应将上述融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，所用的限制酶为ClaI、Xba．目的基因表达载体导入农杆菌时，将农杆菌接种在含四环素的平板上培养得到含融合基因的单菌落，再经纯培养得到浸染液
（4）浸染液中农杆菌在感染油菜时，将融合基因导入油菜细胞并整合到染色体DNA上，这个过程称为转化．利用放射性物质标记的基因（融合基因或酶N基因及转运肽基因）、抗体进行分子杂交，通过检测杂交带的有无，可判断融合基因是否稳定的存在和表达．

Answer 1

分析 1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．
2、cDNA文库和基因文库的比较表：

文库类型	cDNA	基因组文库
文库大小	小	大
基因中启动子	无	有
基因中内含子	无	有
基因多少	某种生物的部分基因	某种生物的全部基因
物种间的基因交流	可以	部分基因可以

解答 解：（1）在已知酶N基因、转运肽基因的上游及下游碱基序列的情况下，可人工设计合成引物用于和模板单链结合，作为多聚核苷酸链延伸的起点．在PCR扩增中所需的关键酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶）．
（2）酶N基因和转运肽基因的一端都有限制酶 Sac I的识别序列，因此形成融合基因前，应用限制酶Sac I处理两个基因，以形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接成融合基因．
（3）融合基因一端有限制酶Cla I的识别序列，另一端有限制酶Xba的识别序列，因此构建目的基因表达载体时，应将上述融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，所用的限制酶为Cla I、Xba．由图可知，标记基因是四环素抗性基因，因此目的基因表达载体导入农杆菌时，将农杆菌接种在含四环素的平板上培养得到含融合基因的单菌落，再经纯培养得到浸染液
（4）浸染液中农杆菌在感染油菜时，将融合基因导入油菜细胞并整合到染色体DNA上，这个过程称为转化．利用放射性物质标记的基因（融合基因或酶N基因及转运肽基因）、抗体进行分子杂交，通过检测杂交带的有无，可判断融合基因是否稳定的存在和表达．
故答案为：
（1）引物   Taq酶
（2）Sac I   DNA连接酶
（3）T-DNA     Cla I、Xba      四环素
（4）转化      放射性物质标记的基因（融合基因或酶N基因及转运肽基因）、抗体

点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，能结合图中信息准确答题．