Question

研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂-内皮抑素，它能有效地抑制血管增生．下面是通过转基因技术获得内皮抑素的方法，请分析回答下列问题：
（1）从肝细胞中分离出RNA，经

 

过程获得cDNA，再通过

 

扩增内皮抑素基因．
（2）扩增的目的基因与PUC18质粒（如图所示）都用EcoRI和BamHI进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒．双酶切避免了目的基因与载体间的

 

连接，提高了重组质粒的比例．
（3）大肠杆菌pUC18质粒上的LacZ基因可表达出B-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被B-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；反之，则形成白色菌落．由此推知，选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入

 

物质．成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成

 

色的菌落，原因是

 

．
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物．将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37℃培养．将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72h后在显微镜下观察细胞存活情况并

 

，实验结果 如表所示．结果说明

 

．

粗提表达产物浓度（μg/ml）	0	2	4	6	8	10
活的内皮细胞数目（x100）	12	6	2	1	0.5	0.5

Answer 1

考点：基因工程的应用

专题：

分析：此题考查了基因工程技术，目的基因的获得方法有三种：从基因文库中获取、PCR技术扩增、人工合成法；基因表达载体中的LacZ基因被插入灭活．据此解题．

解答： 解：（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经反转录（或逆转录）获得内皮抑素基因，再利用PCR技术进行体外扩增，以获得更多的目的基因．
（2）双酶切后，目的基因两端的黏性末端不同，被切开的运载体两端的黏性末端也不同，这样可以避免目的基因与载体反向连接，还能减少目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例．
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有IPTG、X-gal和氨苄青霉素．因为重组质粒的LacZ基因中插入了目的基因，使LacZ基因不能表达出β-半乳糖苷酶，所以成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白色菌落．
（4）由表中数据可知，粗提表达产物浓度越高，活的内皮细胞数目越少，说明重组内皮抑素（或粗提表达产物）能够抑制毛细血管内皮细胞的增殖．
故答案为：（1）反转录   PCR （2）反向  
（3）IPTG、X-gal和氨苄青霉素   白    重组质粒上的LacZ基因已被破坏而不能表达
（4）对活细胞进行计数   内皮抑素能有效地抑制血管增生

点评：本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生的理解应用能力和信息转化能力，属于中等难度题．