Question

12．科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长．质粒上有PstI、SmaI、HindⅢ、AluI等四种限制酶切割位点．如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，I、Ⅱ表示相关结构或细胞．请据图作答：

（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，在该步骤中，可用一种或多种限制 酶进行切割．为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶PstI、SmaI，分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA和质粒进行切割，切割后产生的DNA片段分别为4种和2种．
（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体 I中含有抗氨苄青霉素基因（ampr），作为标记基因．除上述目的基因和标记基因外，基因表达载体 I中还应有启动子、终止子和复制原点．
（3）研究人员通常采用农杆菌转化（或基因枪法等） 法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内．通常采用抗原--抗体杂交技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．

Answer 1

分析 分析图解：鱼的抗冻蛋白基因上具有三种限制酶切割位点，PstⅠ酶的切割位点存在于目的基因的两侧，SmaⅠ酶的切割位点存在于目的基因的左侧，而AluⅠ酶的切割位点存在于目的基因的中央，因此不宜选用AluⅠ酶．质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，在选择限制酶时一般选择同种限制酶，以便形成相同的黏性末端．图中①～④分别表示：基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、脱分化、再分化．

解答 解：（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体；在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段，而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段．
（2）能在含氨苄青霉素的培养基中细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因．基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等．
（3）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法．在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质，通常采用抗原-抗体杂交技术．
故答案为：
（1）构建基因表达载体   PstI、SmaI    含鱼抗冻蛋白基因的DNA和质粒     4    2
（2）抗氨苄青霉素基因（ampr）    启动子    终止子
（3）农杆菌转化（或基因枪法等）     抗原--抗体杂交

点评 本题具有一定的难度，属于考纲中理解层次的要求，考查了基因工程的工具酶、目的基因导入受体细胞以及利用植物组织培养技术培养转基因植株的相关知识，解答的难点是能够根据目的基因和质粒上的切割位点选择合适的限制酶．