Question

【题目】某植物抗虫基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR技术扩增该基因，简要流程如下图所示，其中①③表示有关过程，ⅠⅢ表示有关物质。请回答下列问题：

（1）过程①反应体系中需要加入___________酶，生成杂合双链物质Ⅰ。

（2）利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列AAA(A)n，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ。在过程③反应体系中还需要添加新的引物，新引物的碱基序列应该是________。

（3）得到物质Ⅲ后，通常还需在其两端增加_________序列，以便切割后与相应的运载体重组。将基因表达载体导入大肠杆菌之前，还需用________处理大肠杆菌。

（4）在利用PCR技术扩增某DNA中的某一目的基因时，需要用到的酶是______，依据的原理是_______________。

Answer 1

【答案】逆转录 TTT(T)n 限制酶识别 Ca2+（CaCl2溶液） 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） DNA双链复制（DNA复制）

【解析】

PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。

基因工程的操作步骤：获取目的基因；构建基因表达载体；把目的基因导入受体细胞；目的基因的检测和鉴定。

（1）过程①以mRNA为模板合成DNA属于逆转录过程，需要逆转录酶催化，生成杂合双链物质Ⅰ（一条脱氧核苷酸链，一条核糖核苷酸链）。

（2）利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加AAA(A)n，故在过程③PCR反应体系中还需要添加新的引物，即与左侧AAA(A)n互补的TTT(T)n作为引物。

（3）得到物质Ⅲ即目的基因后，通常还需在其两端增加限制酶序列，以便利用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。将基因表达载体导入大肠杆菌之前，还需用钙离子处理大肠杆菌，使其处于感受态。

（4）PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶参与，PCR的原理是DNA双链复制。