题目内容
【题目】（生物——选修1：生物技术实践）
土壤中含有大量的难溶性磷酸盐，为了从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为能被植物吸收的可溶性磷的优良解磷菌株，科研人员进行了如下实验：
实验原理：固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如图2），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解磷的能力大小。
实验步骤：
步骤1：取某地区土样10g制得土壤溶液并进行一定浓度梯度的稀释，取稀释液1mL接种到基础培养基A上，在适宜温度下培养72h。
步骤2：在基础培养基A上用接种环挑取代表性菌落再次接种，培养3～4d后观察菌落的特征和透明圈的大小，初步筛选出三种优良解磷菌株（如下表）。
菌株 | 透明圈直径（D） | 菌落直径（d） | D/d |
M-3-01 | 18.8 | 12.3 | 1.5 |
B3-5-6 | 20.7 | 8.0 | 2.6 |
T1-4-01 | 9.1 | 6.5 | 1.4 |
（1）步骤1采用的是____________法分离解磷菌株；在统计菌落数目时，需按照菌落计数的要求计数，图1中应选择____________倍稀释度的菌液计数，结果才准确可靠。据图可得出每克土样中解磷菌株的活菌数为____________。
（2）图2中，依次进行的划线的四个区域的面积要求为A＜B＜C＜D，D区面积最大的原因是____________，注意D区划线，不要与____________（填字母）区相连。
（3）为了筛选出所需菌株，培养基中唯一的磷源应该是____________________。培养基上出现的单一菌落可以看作一个____________（填“种群”“群落”或“生态系统”。）根据实验结果可以确定熔解磷能力最强的菌株是____________。
【答案】稀释涂布平板1053.6×l06使该区出现大量的单个菌落以便挑选纯化(或便于菌种分散）A(或A、B)难溶性磷酸盐种群B3-5-6
【解析】
试题在梯度稀释之前，选择培养的目的是增加微生物浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物，而梯度稀释的目的是保证获取纯净的微生物单菌落。
（1）步骤1的目的是从土壤微生物中筛选解磷菌株，由于土壤样液中微生物种类和数量多，因此，最好采用稀释涂布平板法进行接种，从而分离得到解磷菌株。为了保证实验结果准确可靠，一般选择菌落数为30—300之间的平板进行计数，同时为避免偶然因素对实验结果的影响，应选择3个及其以上的平板进行统计取其平均值，故图1中应选择以105倍稀释度的菌液计数，结果才准确可靠。据图可知，在105稀释度下，0.1 mL稀释液中的菌落数为(32 +39 +37)/3 =36，所以每克土样中解磷菌株的活菌数为36×105 ×0.1×10 = 3.6×106(个/克）。
（2）步骤2中采用平板划线法进一步筛选解磷能力强的菌株，故图2中依次进行划线的四个区域的面积要求为A＜B＜C＜D，D区面积最大的原因是使D区域出现大量的单个菌落以供挑选纯化（或便于菌种分散）。采用平板划线法纯化细菌时，要注意不能将最后一区的划线与第一区相连，即D区划线不要与A(或A、B)区相连。
（3）据题可知，培养基中唯一的磷源应是难溶性磷酸盐。据种群的概念，在一定的自然区域内，同种生物的全部个体形成种群，故培养基上出观的单一菌落可以看做一个种群。根据实验原理中“透明圈直径（D)与菌落直径（d)的比值（D/d)代表微生物溶解磷的能力大小”，结合表格数据可以确定解磷能力最强的菌株是 B3-5-6。
【题目】（生物——选修3：现代生物科技专题）
草鱼病毒性出血病是由草鱼呼吸孤病毒（GCRV）引起的，目前尚未找到防治药物。下图是通过基因工程方法将PV7双基因与某质粒连接，并通过草鱼攻毒实验检测免疫保护效果的过程示意图。图中P10和PH为启动子，箭头表示转录方向。PV71和PV72为GCRV外壳蛋白基因（DNA片段）。请回答下列问题：
草鱼病毒性出血病核酸疫苗实验鱼的死亡率和免疫保护率记录表
组别 | 疫苗注射量 | 实验鱼数 | 死亡鱼数 | 死亡率 | 免疫保护率 |
1 | 10μg | 20尾 | 0尾 | 0 | 100% |
2 | 30μg | 20尾 | 0尾 | 0 | 100% |
3 | 60μg | 20尾 | 1尾 | 5% | 95% |
空载体 | 30μg | 20尾 | 6尾 | 30% | 70% |
对照 | 0 | 20尾 | 20尾 | 100% | 0 |
（1制备草鱼病毒性出血病核酸疫苗，获取大量PV7双基因时可采用PCR技术进行扩增，该技术除需要原料、模板、_____________外，还必须用____________酶。PCR一般要经历三十次以上的循环，每次循环包括变性、复性和延伸三个阶段，其中变性是指____________条件下，DNA分子____________的过程。
（2）使用不同的限制酶切割PV71和PV72基因，是为了防止____________，用不同限制酶先后两次切割质粒，是为了防止____________，有利于提高核酸疫苗构建的成功率。
（3）攻毒实验检测是指将不同浓度的核酸疫苗导入草鱼体内，通过转录和翻译产生草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白，使草鱼生成抗体和记忆细胞，同时给草鱼注入相同浓度的GCRV，我，统计草鱼免疫保护率，实验结果说明____________。导入空载体（普通质粒）的草鱼免疫保护率达到70%，但草鱼体内并未检测到抗体水平的明显增加，可能的原因是________________________。核酸疫苗注射后，科学家发现PV7双基因在启动子的驱动下持续表达，至第49天核酸疫苗仍没有被降解，仍能检测到PV7双基因的转录。综上所述，与常规基因工程生产的蛋白质疫苗相比，核酸疫苗所具备的优点有________________________。
