Question

【题目】现有重组质粒甲（共含2686个碱基对，不含T-DNA）和乙，为避免基因反接，研究人员用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割重组质粒甲、乙，再利用所得片段构建了重组质粒丙（下图所示），然后采用农杆菌转化法将丙导入胡萝卜愈伤组织细胞。培养后得到转VP1基因胡萝卜植株。请回答：

（1）构建重组质粒丙的目的是将VP1基因插入到________中，从而使VP1基因进入植物细胞后，能整合到染色体的DNA上。利用重组质粒甲、乙构建丙的过程中，用到的工具酶是____________。

（2）将重组质粒甲、乙和丙进行分组，每组只含其中一种重组质粒，同时用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，结果如下表所示：

组别	切割后所得DNA片段的情况
第1组	只得到含有2146和540个碱基对的2种DNA片段
第2组	只得到含有540和12400个碱基对的2种DNA片段
第3组	只得到含有12400和1000个碱基对的2种DNA片段

切割前，重组质粒甲含有______个游离的磷酸基团，限制酶Ⅰ在重组质粒甲中有________个切割位点，表中第_________组是切割重组质粒丙的结果。

（3）在植物组织培养过程中需要无菌操作，因此对外植体（离体的组织块）要进行_____处理。用于培养外植体的培养基不适用于培养胚状体，原因是_________________________。

Answer 1

【答案】T-DNA 限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA连接酶 0 1 2 消毒 培养基中添加的植物激素（植物生长调节剂）的种类和含量比例有所不同

【解析】

基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。①目的基因的获取方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、通过DNA合成仪人工合成。②基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成。③将目的基因导入动物细胞通常利用显微注射技术；将目的基因导入植物细胞通常用农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入微生物细胞通常用感受态细胞法。④目的基因的检测与鉴定分为分子水平和个体水平，前者包括DNA分子杂交、分子杂交、抗原—抗体杂交法，后者进行个体水平检测如抗虫抗病接种实验。

（1）T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上，由图示可知，重组质粒甲上有目的基因VP1，没有T-DNA，重组质粒乙上含有T-DNA，因此构建重组质粒丙的目的是将VP1基因插入到T-DNA中，从而使VP1基因进入植物细胞后，能整合到染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。构建重组质粒过程需要用到的工具酶有限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA连接酶。

（2）重组质粒甲属于环状DNA分子，含2686个碱基对，在切割前含有0个游离的磷酸基团。由于每组只含其中一种重组质粒，重组质粒丙由重组质粒甲、乙拼接而成，根据表格中切割后的片段碱基数可推得，第1组为重组质粒甲、第2组为重组质粒丙、第3组为重组质粒乙，由于第1组重组质粒甲被限制酶Ⅰ、Ⅱ切割后只得到含有2146和540个碱基对的2种DNA片段，则限制酶Ⅰ在重组质粒甲中只有1个切点。

（3）在植物组织培养过程中需要无菌操作，因此对外植体要进行消毒处理。用于培养外植体的培养基不适用于培养胚状体，原因是培养基中添加的植物激素的种类和含量比例有所不同，前者利于脱分化形成愈伤组织，后者利于再分化形成胚状体。