Question

【题目】利用转基因的工程菌生产药用蛋白，近些年在我国制药行业中异军突起。图1表示基因工程常用的一种质粒。

回答有关问题：

（1）SphⅠ和SacⅠ两种限制酶识别并切割不同的DNA序列，将目的基因和质粒都通过SphⅠ和SacⅠ切割，可以避免_______________。拼接成重组质粒，需要加入_______________酶才能完成。

（2）各限制酶在该质粒上分别只有一处识别序列，有关质粒和重组质粒的限制酶酶切片段长度如下表所示。已知质粒被切除的片段长度为0.5kb，则与质粒结合的目的基因长度为_____

kb。质粒上ClaⅠ与PstⅠ区域之间的长度为2.4kb（图1所示），结合图2分析目的基因上ClaI、PstⅠ两种限制酶的切割位点分别为___________（填“a和b”或“b和a”）。

	质粒	重组质粒
BglⅡ	6.0kb	7.1kb
ClaⅠ	6.0kb	2.3kb， 4.8kb
PstⅠ	6.0kb	1.5kb， 5.6kb

（3）在筛选导入重组质粒的受体菌时，培养基中加入适量的________________，使导入重组质粒和普通质粒的受体菌都能在该培养基上生长。为了进一步筛选，可以利用抗原-抗体杂交的方法，若出现______________，则该受体菌可以作为工程菌。

（4）若要对药用蛋白的结构进行改造，可利用____________工程对目的基因进行修饰。

Answer 1

【答案】目的基因和切割后质粒的自身环化 DNA连接 1.6 a和b 氨苄青霉素 杂交带（抗原-抗体复合物） 蛋白质（第二代基因）

【解析】

基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，一般用同种限制酶切割质粒和目的基因，但容易造成自身环化现象。

（1）目的基因通过SphⅠ和SacⅠ切割产生的末端不同，可避免自身环化，质粒通过SphⅠ和SacⅠ切割，可避免切割后的质粒重新结合而环化；目的基因和质粒结合，需要DNA连接酶连接磷酸二酯键将缺口连接起来。

（2）根据表格信息，质粒为6.0kb，减去被切除的长度为0.5kb的片段，则剩余的为5.5kb，而重组质粒为7.1kb，说明插入的目的基因长度为7.1-5.5=1.6(kb)；质粒上含抗四环素基因的ClaⅠ与PstⅠ区域长度为2.4kb，减去被切取的片段长度为0.5kb后为1.9kb，插入的目的基因长度为1.6kb，所以重组质粒上含抗四环素基因的ClaⅠ与PstⅠ区域长度为1.9+1.6=3.5(kb)，又根据表格信息，通过ClaⅠ切割重组质粒，产生了2.3kb片段，通过PstⅠ切割重组质粒，产生了1.5kb片段。设PstⅠ切割位点为a，ClaⅠ切割位点为b，则会出现图3中所示结果，而2.3+1.5=3.8，3.8﹥3.6，说明a为ClaI切割位点、b为PstⅠ切割位点，反之则不成立。

（3）重组质粒的抗四环素基因已经由于目的基因的插入而破坏，但氨苄青霉素基因完整，培养基中若加入适量的氨苄青霉素，含普通质粒和重组质粒的受体菌都能存活，而没有导入质粒的细菌会死亡而淘汰；若受体菌成功导入重组质粒，并且目的基因正常表达，则可以产生所需的药用蛋白，通过抗原-抗体杂交的方法，若出现杂交带，则该受体菌可以作为工程菌；通过蛋白质工程对目的基因进行修饰，从而实现对已有的药用蛋白进行改造。