Question

【题目】回答下列（一）、（二）小题：

（一）黄素单加氧酶（FMO）是转化吲哚合成靛蓝（一种染料）的一种重要的酶。为提高表达FMO的重组大肠杆菌合成靛蓝的效率，对重组菌进行了固定化研究。回答下列问题：

（1）重组大肠杆菌的扩大培养：用_______________________挑取大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，放在______________________ （ 填设备）上培养过夜，将过夜培养物1mL转移至100mL LB液体培养基中继续培养。该过程所用培养基对于酸碱度的要求是_________________。

（2）重组大肠杆菌的固定化：分别使用卡拉胶、明胶、聚乙烯醇（网格较紧密，扩散性能最低）、海藻酸钠对重组大肠杆菌进行________ （填固定化方式）并分析各自对_________的转化效率。

（3）靛蓝取转化液5mL，离心后，沉淀部分用于靛蓝分析。沉淀用蒸馏水洗两遍，再用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再离心，取上清液于610nm处测定OD值，和________________对照即得到靛蓝浓度。若所测得的OD值过大应采用的最佳措施是________________________。

（4）影响重组大肠杆菌转化吲哚合成靛蓝效率的因素有很多，如：工程菌FMO诱导表达的条件、固定化颗粒的理化性质、反应时间、pH、温度、辅助因子的再生、________________、________________（答出2 点即可）等。

（二）对疑似PRRS（猪繁殖与呼吸综合征）的病料（从得病的动物身上采集的组织或器官）进行病毒分离鉴定，获得一株高致病性PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒） ，通过对高致病性PRRSV的N蛋白进行研究来探讨该蛋白的抗原特性，并制备抗N蛋白的单克隆抗体。回答下列问题：

（1）PRRSV N 蛋白基因的克隆：提取PRRSV中的总RNA，以其中相应的RNA作为模板，利用________________酶逆转录成cDNA。再以cDNA为模板进行________________扩增，而获得N蛋白基因。

（2）表达N蛋白细胞的制备：用重组质粒________________合适的大肠杆菌细胞，为提高该过程的效率，需考虑重组质粒的___________________________等。将筛选过的受体细胞 37℃过夜培养。

（3）单克隆抗体的制备与检测：取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合待融合细胞生长到培养孔底面积的1/10时进行________________________（填物质）筛选。检出的阳性孔用有限稀释法进行多次克隆化，建立单克隆抗体________________。最终获得的单克隆抗体是否达到实验要求的标志是_________________________，与无关蛋白不发生反应。

（4）猪干细胞的应用：胚胎干细胞可以进行________________________________，获得适合猴子移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。

Answer 1

【答案】接种环 摇床 中性偏碱 包埋 吲哚 标准曲线 用蒸馏水稀释样品液 固定化条件 转化过程中底物的浓度 逆转录 PCR 转化 质量和浓度 抗体 细胞株N蛋白 抗N 蛋白的单克隆抗体可与N 蛋白发生特异性的结合 基因敲除

【解析】

（1）梳理大肠杆菌的扩大培养和分离、固定化细胞的方法、亚硝酸盐的定量测定流程等相关知识，即可对（一）题进行解答。
（2）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：一是目的基因的获取，常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法直接人工合成；二是基因表达载体的构建，此步骤需要将目的基因与运载体重组；三是将目的基因导入受体细胞，目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化；四是目的基因的检测与鉴定。
（3）单克隆抗体的制备过程：将从免疫小鼠的脾脏中取出的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合→形成杂交细胞→检验杂交细胞是否产生特定抗体→克隆产生特定抗体的杂交细胞→在体外进行培养或注射到小鼠腹腔内增殖→单克隆抗体。（四）动物基因工程的应用之一是用转基因动物做器官移植的供体：将供体器官基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的克隆器官。

（一）(1)应使用LB液体培养基对重组大肠杆菌进行扩大培养，在此过程中要用接种环挑取大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中。接种后，应放在摇床上振荡培养。细菌要求在中性偏碱(6.5～7.5)的环境中生长，所以该过程所用培养基对于酸碱度的要求是中性偏碱。

(2)因大肠杆菌细胞个大，难以被吸附或结合，所以多采用包埋法对重组大肠杆菌进行固定化。依题意可知：黄素单加氧酶（FMO）是转化吲哚合成靛蓝（一种染料）的一种重要的酶，该实验对重组菌进行固定化研究的目的是为提高表达FMO的重组大肠杆菌合成靛蓝的效率，所以需要分析被不同材料固定化的大肠杆菌各自对吲哚的转化效率。

(3) 分析靛蓝时，取上清液于610nm处测定的OD值，需要与标准曲线对照才能得到靛蓝浓度。若所测得的OD值过大，则应用蒸馏水稀释样品液。

(4) 固定化条件、转化过程中底物的浓度等都会影响FMO的活性，进而影响重组大肠杆菌转化吲哚合成靛蓝效率。

（二）(1) 以RNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶参与催化。以cDNA为模板，利用PCR技术可以对cDNA进行扩增，进而获得N蛋白基因。

(2) 制备表达N蛋白的细胞，需将N蛋白基因与质粒重组，并将重组质粒导入大肠杆菌细胞中。N蛋白基因进入大肠杆菌细胞内，并在大肠杆菌细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。为提高转化的效率，需考虑重组质粒的质量和浓度等。

(3) 制备单克隆抗体时，首先取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，待融合细胞生长到培养孔底面积的1/10时进行抗体筛选。检出的阳性孔用有限稀释法进行多次克隆化，建立单克隆抗体细胞株N蛋白。若最终获得的单克隆抗体可与N 蛋白发生特异性的结合，与无关蛋白不发生反应，则达到实验要求。

(4) 将猪的胚胎干细胞中的抗原决定基因敲除，再结合克隆技术，获得适合猴子移植的猪器官，以减弱或消除排斥反应。