题目内容
【题目】基因工程重要环节是构建基因表达载体。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列和切割位点，图2表示DNA片段，图3表示目的基因及限制酶切点，图4表示质粒。请回答下列问题：
（1）若图2就是图1中的最左边显示的三个碱基对，则④⑤⑥⑦⑧⑨对应的碱基依次是________。限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，切开的位置是图2中编号为______位置的________键。
（2）已知DNA复制子链的延伸方向是5′→3′，图3中的A、B、C、D在不同情况下可以作为引物，在PCR技术中，扩增此目的基因，应该选用________两个作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生目的基因片段__________个。
（3）图4中，如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对此质粒进行三种方法切割。第一种方法用其中一种酶、第二种方法用其中两种酶、第三种方法用其中三种酶分别切割，依次产生_______、_______、_____三种片段。
（4）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用____________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经____________处理过的_____________态的大肠杆菌中。
【答案】AAGTTC ③ 3，5磷酸二酯键 B和C 16 3 6 3 PstⅠ、EcoRⅠ DNA连接 Ca2+ 感受
【解析】
基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
（1）若图2就是图1中的最左边显示的三个碱基对，即G-C、A-T、A-T，由于图1中G位于一条链中5，端，对应图2中⑥，图1中C位于另一条链的3，端，所以对应图2中另一条链中⑨，由此确定图2中④⑤⑦⑧⑥⑨对应的碱基依次是AAGTTC。DNA分子的一条多核苷酸链中，两个脱氧核苷酸之间以磷酸基团和五碳糖相连．由题目可知，EcoRⅠ识别的DNA序列只有G和A，故切开的是鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸（即图2中③）之间相连的3，5-磷酸二酯键。
（2）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，DNA复制只能从5’到3’，因此构建前利用PCR技术扩增目的基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取 B和C 作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生基因片段16个。
（3）如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对质粒进行切割，若Pst I酶的切割位点用1表示，EcoR I酶的切割位点用2表示，HindⅢ酶的切割位点用3表示，若用其中一种限制酶切割，每次只有一个切点，则形成1→1，2→2，3→3三种片段；若用其中两种限制酶切割，则每次只有两个切点，则形成的DNA片段1→2，2→1，2→3，3→2，1→3，3→1六种片段；若用其中三种限制酶切割，由于产生3个切点，则形成1→2，2→3，3→1三种片段。
（4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，四环素抗性基因没有被破坏，应该选择的限制酶是 PstⅠ、EcoRⅠ。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经钙离子处理过的感受态的大肠杆菌中。
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