Question

【题目】I.泡菜发酵过程中会产生亚硝酸盐。请回答：

（1）泡菜制作过程中所利用的微生物主要是_____，其代谢类型为_____该微生物与酵母菌在细胞结构方面最主要的区别为_____。

（2）实验中利用比色法测定泡菜液中亚硝酸盐含量，其中的显色原理是：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生_______反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成_____色染料。

（3）泡菜发酵初期，亚硝酸盐含量快速升高的原因是__________。有人认为，发酵后期亚硝酸盐含量降低的原因可能是“泡菜发酵的主要菌种能够降解亚硝酸盐”。请设计一个实验验证该观点（写出实验思路即可）。____________________。

Ⅱ.海洋石油污染日益引起关注，利用工程菌进行降解具有巨大的应用潜力。P450是石油降解的关键酶，用Sall和Nde I联合酶切获得的P450基因，与质粒pCom8重组后，导入大肠杆菌获得工程菌。

（注：黑色素合成基因表达能使白色菌落变成黑色，箭头位置表示限制酶切割位占）

请回答：

（1）构建重组质粒时，应选用限制酶________切割pCom8，原因是________。

（2）由于重组质粒导入受体细胞的成功率很低，所以需要经过________才能获得工程菌。操作的大致思路是：将待检菌液接种到含有________的固体培养基上，选择颜色为________的菌落扩大培养，即可获得所需的工程菌

（3）从工程菌中提取重组质粒，若用Nde I y Sall联合酶切，是否能得到P450基因？________（填“是”或“否”），理由是________________。

Answer 1

【答案】乳酸菌 异养厌氧型 没有核膜包被的细胞核 重氮化 玫瑰红 微生物大量繁殖，代谢产生的亚硝酸盐增加 取泡菜发酵的主要菌种，在含亚硝酸盐的培养基中培养，一段时间后检测培养基中亚硝酸盐的含量。若下降，则证明该观点正确 XhoI和NdeI 用这两种酶切割pCom8质粒后，产生的末端能与P450基因的粘性末端互补 筛选 庆大霉素 白色 否 当P450基因与被限制酶XhoI和NdeI切割的pCom8质粒重组后，不存在能被限制酶SalI识别的序列

【解析】

I泡菜制作的过程运用了传统的发酵技术，泡菜制作所使用的微生物是乳酸菌，乳酸菌的代谢类型是异养厌氧型，在无氧条件下乳酸菌能够大量繁殖，并把糖转化为乳酸，膳食中的亚硝酸盐在特定的条件下会转变为致癌物，在泡菜腌制过程中，由于坛内环境中硝酸还原菌的繁殖，促进硝酸盐还原为亚硝酸盐，但随腌制时间延长，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，抑制硝酸盐还原菌繁殖，使亚硝酸盐含量逐渐下降。

Ⅱ分析图1:图1中限制酶XhoI的切割位点位于黑色素合成基因上,该基因表达能使白色的菌落变成黑色;限制酶SspI的切割位点位于庆大霉素(一种抗生素)抗性基因上。

分析图2:图2表示几种限制酶的识别序列和切割位点,其中SaI和XhoI切割后露出的黏性末端是相同的。

I (1)泡菜制作过程中所利用的微生物主要是乳酸菌，其代谢类型为异养厌氧型。乳酸菌是原核生物，与酵母菌在细胞结构方面最主要的区别为没有核膜包被的细胞核。

(2)实验中利用比色法测定泡菜液中亚硝酸盐含量，显色原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。

(3)泡菜发酵初期，亚硝酸盐含量快速升高的原因是微生物大量繁殖，代谢产生的亚硝酸盐增加。有人认为，发酵后期亚硝酸盐含量降低的原因可能是“泡菜发酵的主要菌种能够降解亚硝酸盐”。实验验证该观点的实验思路是：取泡菜发酵的主要菌种,在含亚硝酸盐的培养基中培养，一段时间后检测培养基中亚硝酸盐含量若下降，则证明该观点正确。

Ⅱ(1)根据题干信息“用Sall和Nde I联合酶切获得的P450基因”可知获取目的基因时用的限制酶是Sall和Nde I,由于质粒中没有限制酶Sall的切割位点,又因为乙图显示Sall和XhoI切割后露出的黏性末端是相同的,因此可以用Nde I、XhoI切割质粒。

(2)由于重组质粒导入受体细胞的成功率很低,所以需要经过筛选才能获得工程菌。由于重组质粒上含有标记基因-庆大霉素(一种抗生素)抗性基因,因此培养基中还必须添加庆大霉素。甲图中XhoI是黑色素合成基因,其表达能使白色的菌落变成黑色,但在构建基因表达载体时,该基因已经被限制酶切割和破坏了,因此导入重组质粒的工程菌不能合成黑色素,即应该选择白色菌落扩大培养即可获得所需的工程菌。

(3)当P450基因与被限制酶Nde I和XhoI切割的pCom8质粒重组后,不存在限制酶Sall识别的序列,因此若对重组质粒再次使用上述限制酶(Nde I、XhoI)切割,由于只有限制酶Nde I能起作用,因此不能获得P450基因。