Question

12．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因．利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示，请回答下列问题．

（1）将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状（变异性状）的来源属于基因重组．
（2）在构建重组质粒时，应选用SalⅠ和HindⅢ（填SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ）两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性．
（3）基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤．为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，图2表示运用影印培养法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入了农杆菌．培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素．
从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是4和6（填序号）菌落中的细菌．为了确定抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测抗盐基因，又要用一定浓度的盐水浇灌烟草植株的方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性．
（4）将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用植物组织培养技术，愈伤组织经细胞的增殖和分化进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素．
（5）图3表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答：组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造．图4是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（图示部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：
①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入启动子．
②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的之一是去除质粒上的tms和tmr（基因），保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长．
③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒．分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．

Answer 1

分析 根据题意和图示分析可知：图1所示为转基因抗盐烟草的培育过程，首先构建基因表达载体；其次采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞（烟草细胞）；再采用植物组织培养技术将含有目的基因的烟草细胞培养成转基因抗盐烟草．
图2所示为筛选含有重组质粒的农杆菌的过程，培养基A和B中应该分别加入氨苄青霉素、四环素．
图3所示，①时基因表达载体的构建，②将目的基因导入受体细胞，③用农杆菌侵染水稻胚细胞，④植物组织培养．
图4是基因表达载体，其组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因．标记基因可以筛选出含有目的基因的细胞．

解答 解：（1）基因工程的原理是基因重组．
（2）由于BamHⅠ酶识别的DNA序列在抗盐基因中间，用该酶切割会破坏目的基因，所以在构建重组质粒时，应选用SalⅠ和HindⅢ两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性．
（3）用SalI和HindⅢ两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素培养基上生存．所以培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素，含目的基因的是4和6菌落中的细菌．探针是指用放射性同位素标记的目的基因（抗盐基因）．除了从分子水平上进行检测，还可以从个体水平上进行鉴定，即用一定浓度的盐水浇灌烟草植株来鉴定烟草的耐盐性．
（4）将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要利用植物细胞的全能性，用植物组织培养技术，愈伤组织经细胞的增殖和分化进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加适宜比例的生长素和细胞分裂素．
（5）①基因表达载体组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因，要使抗虫基因能成功表达，还应插入启动子．
②tms的编码产物控制合成吲哚乙酸和tmr的编码产物控制合成细胞分裂素．因此用限制酶Ⅱ处理tms和tmr基因，可以保证T-DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长．
③若用限制酶Ⅰ分别切割经过②过程，破坏了四环素抗性基因，受体细胞不具有抗四环素功能，但可以抗卡那霉素．分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
故答案为：
（1）基因重组
（2）SalⅠHindⅢ
（3）氨苄青霉素　四环素（氨苄青霉素和四环素）　4和6　抗盐基因
（4）植物组织培养　　植物激素
（5）①启动子
②tms和tmr
③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长

点评 本题结合转基因抗盐烟草的培育过程图，考查基因工程、植物组织培养等知识，要求考生识记基因工程的原理、工具及操作步骤，能根据图中限制酶的位置及题干要求选择正确的限制酶；能根据题中信息判断培养基中抗生素的名称；识记植物组织培养过程及条件．