Question

【题目】自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。

（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用_______________________的培养基进行分离，这种培养基属于______培养基（按功能分类）。可在培养基中加入_________指示剂对该类微生物鉴别。

（2）若取土样6g，应加入_______mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为_______________。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中_______倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为__________ 。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目_______（低/高）。

稀释倍数		103	104	105	106	107
菌落数 （个）	1号平板	478	367	277	26	5
	2号平板	496	354	261	20	8
	3号平板	509	332	254	29	3

（3）若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_______________________。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102 ，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。

Answer 1

【答案】尿素作为唯一的氮源 选择培养基 酚红 54 稀释涂布平板法 105 2.2×107 低 将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落 2.25×108

【解析】

本题是考查土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的知识，筛选尿素分解菌需要使用尿素为唯一的氮源的选择培养基，尿素分解菌可以使用酚红指示剂进行鉴定；稀释涂布平板法接种可以用来进行微生物的计数。

（1）分解尿素的细菌，其氮源是尿素，而其他微生物的氮源是有机氮，所以欲分离分解尿素的细菌，应用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行分离，并加入酚红指示剂进行鉴别。

（2）根据题意分析，需要稀释10倍的土壤溶液，因此应该将6g土样加入到54mL的无菌水进行配制；将103-107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入到固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上；估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30 到300之间的平板，分析表格是数据可知，105的稀释度平板菌落数在这一范围；每克土壤中的菌落数为（277+261+254）÷3×105÷0.2÷6=2.2×107。稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于菌落之间会相互重叠，因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。

（3）用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格（体积为0.1mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102 ，那么原菌液的菌群密度=45×5÷0.1÷10-3×102=2.25×108个/mL。