Question

2．多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果胶使细胞壁破损．成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜．利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期．科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图．据图回答下列问题：

（1）若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．已知BamHI的识别序列如图2甲所示，请在图2乙相应位置画出目的基因两侧的黏性末端．
（2）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选，理由是重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏．之后，还需将其置于质量分数为0.3g/ml的蔗糖溶液中，观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．
（3）由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与天然的PG基因转录的mRNA互补结合，因此可抑制PG基因的正常表达．若番茄果实的保质期延长，则可确定转基因番茄培育成功．
（4）将转入反向链接PG基因的番茄细胞培育成完整的植株，需要用植物组织培养技术；其中，愈伤组织经再分化（或细胞增殖和分化）形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素（生长调节剂、生长素和细胞分裂素）．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．根据BamHⅠ的识别序列，可知目的基因两侧的黏性末端为：．
（2）由图可知，重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏，因此用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选．之后，还需将其置于质量分数为0.3g/ml的蔗糖溶液中，观察细胞细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．
（3）由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与天然的PG基因转录的mRNA互补结合，因此可抑制PG基因的正常表达．若番茄果实的保质期延长，则可确定转基因番茄培育成功．
（4）将转基因番茄细胞培育成完整植株需采用植物组织培养技术，其过程为转基因番茄细胞$\stackrel{脱分化}{→}$愈伤组织$\stackrel{再分化}{→}$胚状体→转基因番茄，该技术操作过程中除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素即生长素和细胞分裂素．
故答案为：
（1）逆转录法    
（2）卡那霉素      重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏       是否发生质壁分离
（3）天然的PG基因转录的mRNA      番茄果实的保质期延长
（4）植物组织培养      再分化（或细胞增殖和分化）     植物激素（生长调节剂、生长素和细胞分裂素）

点评 本题结合转基因番茄形成的流程图，考查基因工程、植物组织培养等知识，要求考生掌基因工程的原理和具体操作步骤，认真分析转基因番茄形成的流程图，理解转基因番茄的保质期时间长的原因；识记植物组织培养的过程及应用，能结合图中信息准确答题．