Question

13．凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶．直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向．用紫外线照射芽孢杆菌，分离、培养，并检测各菌株所产生的凝乳酶活力．操作过程如图1所示．请分析回答：

（1）图1所示的b过程的目的是为获得单个菌落．
（2）在一定温度下（35℃），一定时间内（通常为40分钟），凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量为一个酶活力单位（U）．凝乳酶活力检测结果如图2所示．
①据图2所示，酶催化能力最强的是A₆组．
②A₂、A₅组酶活力与A0组芽孢杆菌相同，两位同学对此做出了推测：
同学甲：A₂、A₅组芽孢杆菌未发生基因突变，因为基因突变具有低频性（稀有性）的特点．
同学乙：A₂、A₅组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，其依据的理由是一种氨基酸可能对应多种密码子（基因突变发生在非编码区）．为了验证上述2位同学的假设，可采用DNA分子杂交（DNA测序）技术检测凝乳酶基因是否发生了突变．
（3）从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中．
①从牛胃细胞中提取mRNA，再逆转录形成DNA．以此DNA为模板PCR扩增目的基因．
②构建重组DNA分子（如图3所示）最好选用BamHI和PstI限制酶，理由是提高重组DNA分子的比例（防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接）．
③工业化生产过程中，最初多采用重组大肠杆菌或芽孢杆菌生产凝乳酶，现多采用重组毛霉生产，毛霉作为受体细胞的优势是含有内质网和高尔基体可对蛋白进行加工和修饰．

Answer 1

分析 据图分析：图1所示的b过程为菌落的稀释，培养基中含有多种酶活力不同的突变芽孢杆菌．图2中，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是6组．由图3可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI．

解答 解：（1）图1所示的b过程为菌落的稀释，目的是为获得单个菌落；由图可知培养基中含有多种酶活力不同的突变芽孢杆菌，故接种用的平板培养基不是选择培养基．
（2）①据图2所示，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是A6组，故酶催化能力最强的是A6组．②同学甲：基因突变有低频性的特点，故很可能使A2、A5组的细菌均未发生基因突变．同学乙：如果A2、A5组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，这可能是因为一种氨基酸可能对应多种密码子，随基因发生突变，但不会改变翻译出来的氨基酸；也可能是因为发生基因突变的区段为非编码区．为了验证上述2位同学的假设，可采用DNA分子杂交技术检测凝乳酶基因是否发生了突变．
（3）①牛胃细胞中含有能翻译出凝乳酶的mRNA，可逆转录得到cDNA．构建重组DNA分子时，需用同种限制性内切酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5’端设计限制酶识别序列，以便构建重组DNA分子．
②由图3可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI，因此构建重组DNA分子最好选用BamHI和PstI限制酶，这样可以防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接．
③毛霉较重组大肠杆菌或芽孢杆菌作为受体细胞的优势是毛霉为真核微生物，含有内质网和高尔基体可对蛋白进行加工和修饰．
故答案为：
（1）单个菌落
（2）①A₆
②低频性（稀有性）      一种氨基酸可能对应多种密码子（基因突变发生在非编码区）     DNA分子杂交（DNA测序）
（3）①mRNA
②BamHI和PstI       提高重组DNA分子的比例（防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接）
③含有内质网和高尔基体可对蛋白进行加工和修饰

点评 本题结合图示主要考查基因工程的原理及技术基因工程的应用蛋白质工程，意在强化相关知识的识记、理解与运用．