从基因文库中获取

鸟枪法

人工合成

3．目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)

1、基因工程的操作工具

　　 (1)分子手术刀--限制性核酸内切酶

　　 限制性核酸内切酶简称限制酶，主要存在于原核生物中，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。目前已经发现了200多种限制酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式--黏性末端和平末端(如下图所示)。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

　　 注意：①用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸二酯键(即连接相邻两个脱氧核苷酸的键)。

②黏性末端是指双链DNA分子被限制酶切开后，切口处的两个末端伸出的由若干特定核苷酸组成的单链。

(2)分子缝合针--DNA连接酶

从上图中可以看出，把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让二者的黏性末端按碱基互补配对原则形成双链，用DNA连接酶催化两条DNA链的相邻两个碱基之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核苷酸连接起来。DNA连接酶有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coli DNA连接酶；另一类是从T₄噬菌体中分离出来的．称为T₄ DNA连接酶。E·coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T₄-DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低

(3)分子运输车一--基因进入受体细胞的载体

　　 ① 使用运载体的目的

　　 在基因工程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。

　　 ② 运载体的种类

　　 现在所利用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌核区DNA之外的双链环状DNA。另一类运载体是噬菌体或某些灭活的病毒等。现在人们还在寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体等也有可能成为运载体。

　　 ③ 基因的运载体必须具备的条件

　　 a．载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而导致其自身失活。

　　 b．载体DNA必须具备自我复制的能力，或可以整合到受体染色体DNA上随受体染色体DNA的复制而同步复制。

　　 c．载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

　　 d．载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，不能进入到除受体细胞以外的其他生物细胞中去。

　　 e．载体DNA分子大小应适中，以便提取和在体外进行操作，太大则不便操作。

　　 一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改造现在使用的质粒载体几乎都是经过改造的。

(三)基因工程的应用

1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。

(二)基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。

3.PCR技术扩增目的基因

(1)原理：DNA双链复制

(2)过程：第一步：加热至90-95℃DNA解链；第二步：冷却到55-60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因

(1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。

(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca²⁺ 处理细胞，使其成为　 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达

1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

(一)基因工程的基本工具

1.“分子手术刀”--限制性核酸内切酶(限制酶)

(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2.“分子缝合针”--DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T_4-DNA连接酶)的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E·coliDNA连接酶来源于T₄噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T₄DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同:­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”--载体

(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

(2)最常用的载体是­­质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

(3)其它载体：　 噬菌体的衍生物、动植物病毒

DNA是遗传物质的证明

理论基础　　 DNA双螺旋结构和中心法则的确立

遗传密码的破译

　　　　　　 基因转移载体的发现

　　　　　　 工具酶的发现

　　　　　　 DNA合成和测序技术的发现

工程技术　　 DNA体外重组的实现

重组DNA表达实验的成功

第一例转基因动物的问世

PCR技术的发明

　　　　　　　　　　 来源：主要从原核生物中分离

　　　　　　　　　　 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，

限制性内切酶　　　　　 并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷

(分子手术刀)　　　　　 酸二酯键断开。

切割后的DNA末端：　 黏性末端

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 平末端

　　　　　　　　 功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子

DNA连接酶　　　　　　 T₄ DNA连接酶：既能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，

(分子缝合针) 种类　　　　　　　　 也能“缝合”双链DNA的平末端

E·coli DNA连接酶：只能将双链片段互补的黏性末端连接

能在宿主细胞中保存下来并大量复制

　 　条件： 有一个至多个限制酶切割点，

基因进入受体细胞的载体　　　　　 有特殊的遗传标记基因，便于筛选。

(分子运输车)　　　　　　 　　　 质粒(常用)

种类：　 λ噬菌体的衍生物

动植物病毒

　　　　　　　　　 　 　基因文库

　　　　　　　　　　 　　从基因文库中获取　　　 基因组文库

目的基因的获取方法　　　　　　　　 　 　　　　 部分基因文库

　　　　　　人工合成

　　　　　　 　　　　　PCR：是一项在生物体外复制特定

　　　DNA片段的核酸合成技术。

利用PCR技术扩增目的基因　 目的：获取大量的目的基因

原理：DNA复制

　　　　　　　　　　　　　　 过程

　　　　　　　　 　　目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，

基因表达载体的构建　　　 并使目的基因能够表达和发挥作用。

(基因工程的核心)　　　　　　　　　　　　 目的基因：

基因表达载体的组成：　 启动子：

　　　　　　　　　　 终止子：

　　　　　　　　　　 标记基因：

　　 转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定

和表达的过程

农杆菌转化法

导入植物细胞的方法： 基因枪法

将目的基因导入受体细胞　 方法：　　　　　　　　　　　　 花粉通道法

　　　　　　　　　　　　　　　　 导入动物细胞的方法： 显微注射技术

　　　　　　　　　　　　　　　　　　 导入微生物的方法：

　　　 　　　　　　　　　　　检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因

　　　　　　　　　　 检测：　　 方法：分子杂交技术(DNA探针+转基因生物DNA)

目的基因的检测和鉴定　　　　 检测目的基因是否转录

　　　　　　　　　　　　　　　 方法：分子杂交技术(DNA探针+转基因生物mRNA)

检测目的基因是否翻译成蛋白质　　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　 　　　　　抗原-抗体杂交

　　　　　　　　　　　 鉴定：对生物进行个体水平的鉴定

　　　　　　　　　 抗虫转基因植物

　　　　　　　　　 抗病转基因植物

转基因植物　 抗虫逆转基因植物

　　　　　　　　　 改良植物品质

　　　　　　　　　 提高动物生长速度

　　　　　　　　　 改善畜产品的品质

　 转基因动物　　 用转基因动物生产药物

　　　　　　　　 　用转基因动物作器官移植的供体

基因工程药物

　　 基因治疗

基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

2、考点解读

基因工程属于生物科技前沿的内容，这一专题的教学，首先要考虑基础性。高中阶段的教学不是培养专家，而是要全面提高学生的科学素养，因此，着力点应瞄准对学生的发展起根本作用的知识、能力、思想情感上。忽视了这一点，而一味追求知识的深和透，就会本末倒置，影响学生的全面发展。

本专题教学的另一个重要原则就是要在学生原有的知识、经验基础上提升。违背了渐进性，易使学生认为“基因工程难学”而产生“危乎高哉”的想法，望而却步。紧密联系学生已有的经验、生活阅历，尽量紧密联系必修课中的基础知识，一步步引领学生登上这一科技前沿的舞台，学生们才会心驰神往地投入到学习中来。

在学习本专题内容时，不能忽视知识与能力、情感态度与价值观的有机结合。情感态度与价值观是学习的动力，要利用国际上重大科技成果的素材，开阔学生的视野，增强他们奋发图强的紧迫感；利用国内重大科技成果的素材，培养他们自强不息的民族精神，从而唤起他们学习的积极性。

本专题多数内容都与其他专题有紧密的联系。关于转基因生物，在学习技术知识的基础上应引导学生主动学习《生物技术的安全性和伦理问题》专题。《胚胎工程》中有关胚胎移植技术的内容，可使学生对培育转基因动物有更加透彻的理解。《细胞工程》中介绍植物细胞培养技术，是目的基因导入植物细胞、培育转基因植物的重要环节。另外，学习本专题内容时，密切关注《生态工程》专题中呈现的生态环境问题，思考利用基因工程的方法，解决生态环境问题中常规技术难以解决的问题。

1、考点盘点

内容	说明
(1)基因工程的诞生； (2)基因工程的原理及技术； (2)基因工程的应用；	说出基因工程的概念 简述基因工程的诞生历程 认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新 分析基因工程研究的理论基础 说出DNA重组技术所需的三种基因工具的作用 简述基因工程基本操作程序的四个步骤 简述目的基因的获得、运载体的构建、目的基因的导入与检测等常用的方法及其基本原理 举例说出基因工程在农业、医疗、环境保护等方面的广泛应用及其发展前景 关注基因工程的发展，认同基因工程的应用促进生产力的提高

6. (江苏宿迁市2009届高三冲刺练习一，生物，32)(6分)某同学尝试在适宜的条件下制作果酒和果醋，发酵装置如甲图所示，在消毒后的锥形瓶中装入新鲜的葡萄汁后封闭通气口，进行自然发酵。发酵初期将温度控制在18-25℃，可见溶液中有大量气泡产生；中期可以闻到酒香；后期接种醋酸杆菌，适当升高温度到30-35℃并通气，酒香逐渐变成醋香。分析并回答下列问题：

(1)发酵开始时封闭通气口的原因是酵母菌　　　　　　　　　 。与醋酸杆菌相比较，酵母菌细胞结构上的主要特点是　　　　　　　 。

(2)接种醋酸杆菌，适当升高温度到30-35℃并通气，可以说明醋酸杆菌　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

(3)图乙中能表示整个发酵过程培养液pH变化的曲线是　　　　　　 。